предметів
реферат
Коензим Q10 (CoQ 10) відіграє важливу роль в метаболізмі енергії мітохондрій завдяки своїй функції електроносія в дихальному ланцюзі. Генетичні дефекти, що порушують ендогенний біосинтетичний шлях CoQ 10, можуть призвести до серйозних метаболічних порушень з початком у ранньому дитинстві. Використовуючи секвенування екзоми у дітей із летальним неонатальним молочнокислим ацидозом та енцефалопатією, ми виявили гомозиготний варіант втрати функції в COQ9. Функціональні дослідження у пацієнтів з фібробластами показали, що відсутність білка COQ9 супроводжувалося сильним зниженням COQ7, що призводило до значного накопичення субстрату COQ7, 6-деметокси-убихінону 10. У той же час загальна кількість CoQ 10 була значно зменшена, що виразилось у значному зниженні активності мітохондріального дихального ланцюга сукцинат-цитохром с оксидоредуктази (комплекс II/III). Лентивірусна експресія COQ9 відновила всі ці параметри та підтвердила причинну роль варіанту. Наш звіт про другого пацієнта з COQ9 розширює клінічний спектр, асоційований з варіантами COQ9, підкреслюючи важливість COQ9 під час внутрішньоутробного розвитку. Крім того, порятунок клітинних рівнів CoQ 10 та складна активність дихального ланцюга шляхом доповнення CoQ 10 вказує на важливість ранньої діагностики та негайного лікування.
Коензим Q10 (CoQ 10) - це жиророзчинна речовина, природна речовина, яка діє як важливий кофактор в дихальному ланцюзі мітохондрій. 1 Він діє як електронний носій від комплексу I та комплексу II до комплексу III і, таким чином, проходить окислювально-відновний цикл між окисленою (убихінон) та відновленою формою (убихінол). Крім того, CoQ 10 пов'язує мітохондріальне бета-окислення жирних кислот з дихальним ланцюгом, бере участь у біосинтезі піримідину та модулює апоптоз. 2 У своїй відновленій формі молекула CoQ 10 служить потужним антиоксидантом.
CoQ 10 отримують шляхом біосинтезу або дієтичного споживання. Однак біосинтез є основним джерелом CoQ10, який включає скоординовану функцію принаймні 13 генів (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ3, COQ4, COQ5, COQ6, COQ7, ADCK3, ADCK4, COQ9, COQ10A та COQ10B). На сьогодні дефекти восьми з цих генів визначені причиною первинних розладів дефіциту CoQ 10 (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ4, COQ6, ADCK3, ADCK4 та COQ9), клінічно неоднорідною групою захворювань, які часто проявляються в дитячому віці ., 4 За даними Quinzii et al. Можна виділити 5 основних клінічних фенотипів: (1) енцефаломіопатія, (2) важка дитяча мультисистемна хвороба, (3) нефропатія, (4) мозочкова атаксія та (5) ізольована міопатія. Визначення дефіциту CoQ 10 є важливим, оскільки добавки CoQ 10 можуть бути корисними за певних умов.
На сьогоднішній день повідомляється лише про одного пацієнта з дефіцитом CoQ 10 через варіант гомозиготного арешту при COQ9 c.730C> T, р. Arg244 *, що призводить до молочнокислого ацидозу новонароджених, неконтрольованих судом та загальної затримки розвитку. Використовуючи секвенування екзоми, ми виявили новий варіант впливу на функцію COQ9, пов’язаний з енцефалопатією новонароджених та ранньою смертю. Наш звіт розширює клінічний спектр, асоційований з варіантами COQ9, і вказує на важкий фенотип до/новонародженого. Детально охарактеризовані фібробласти пацієнтів з дефіцитом COQ9 та показані функціональні наслідки генетичного дефекту.
Звіт про справу
Хлопчик повідомив, що тут є другою дитиною здорових першокласних турецьких батьків. Його 13-річний брат здоровий. Вагітність була нормальною до 27-го гестаційного тижня, коли відзначалося олігогідрамніон. Тоді батьки відхилили рекомендований кесарів розтин. Нарешті, дитина народилася на 36-му тижні вагітності шляхом кесаревого розтину через безводдя. Оцінка APGAR становила 5/4/6. Новонароджений був малим для гестаційного віку, з вагою при народженні 1440 г, довжиною 39,5 см і окружністю голови 28,8 см (усі значення нижче 3-го процентиля). Дисморфічних стигм не спостерігалося. Протягом безпосереднього постнатального періоду у пацієнта були слабкі дихальні зусилля, м’язова гіпотонія, брадикардія та генералізований ціаноз. Дитину інтубували та перевели до відділення інтенсивної терапії новонароджених. Лабораторні дослідження виявили молочнокислий ацидоз (до 22 ммоль/л; стандарт: 160), що вказує на дефект метаболізму CoQ 10. Гістологічне дослідження м’язової та печінкової тканин не проводили конкретних досліджень.
a ) УЗД головного мозку у новонародженого з патогенним варіантом COQ9. Ліва та середня панелі: правий та лівий парасагітальний види, відповідно, показують гіперехогенний сигнал у базальних гангліях (стрілка) та двосторонніх кіорозах сплетення судинної оболонки (зірочка). Права панель: корональний вигляд, що демонструє симетричні аномалії гіперехогенних базальних гангліїв, що вказує на синдром новонародженого, схожий на Лі. ( b ) Принципова схема, що показує розшифровку, сформовану за наявності делеції c.521 + 1. Хроматограма показує, що делеція спричиняє пропуск екзонів 4 та 5 у фібробластах пацієнта. ( c ) Вестерн-блот на фракціях пацієнтів та контрольні фібробласти, збагачені мітохондріями (репрезентативне зображення). У клітинах пацієнтів не виявляється неперетвореного (Q) COQ9. Сигнал відновлюється після лентивірусної трансдукції з кДНК CQ9 дикого типу (+). Крім того, було використано антитіло COQ7, яке продемонструвало значне зниження білка COQ7 у клітинах пацієнтів. Porin (VDAC) використовували як маркер завантаження.
Повнорозмірне зображення
Матеріали і методи
Детальний опис матеріалів та методів, використаних у цьому документі, можна знайти в додатковому матеріалі.
Результати і обговорення
Щоб виявити генетичну причину захворювання, ми провели секвенування екзоми, як описано вище. 7 Припускаючи аутосомно-рецесивний спосіб успадкування, наші аналізи зосереджувались на гомозиготних та прогнозованих гетерозиготних несинонімічних варіантах з MAF 9
Далі ми дослідили вплив варіанта на експресію COQ9 шляхом імунодеколяції збагачених мітохондріями білків за допомогою антитіла, специфічного для COQ9. Використовуючи різну кількість мітохондріальних білків, ми не змогли виявити COQ9 у клітинах пацієнтів, тоді як ми завжди виявляли COQ9 у контролі, вказуючи на деградацію усіченого білка (рис. 1в).
Крім того, ми виміряли декілька мітохондріальних ферментів спектрофотометрично, використовуючи збагачені мітохондріями фракції фібробластів. Для визначення активності дихального ланцюга II/III ми вимірювали відновлення цитохрому c. Щодо активності комплексу IV ми відстежували окислення відновленого цитохрому с та вимірювали активність цитратсинтази, ферментативного маркера матриксу мітохондрій, після відновлення 5,5'-дитиобіс- (2-нітробензойної кислоти). Відповідно до дефекту біосинтезу CoQ 10 та дефекту, виявленого у фібробластах, клітини пацієнта демонстрували значне зниження активності комплексу II/III (рис. 2а).
Експресія COQ9 у контрольних клітинах з нормальним або зниженим рівнем CoQ 10 через варіанти COQ2 не впливала на активність комплексу II/III (рис. 2а). Однак після експресії кДНК дикого типу у фібробластах пацієнтів із варіантами COQ9 ми спостерігали значне 4-кратне збільшення активності комплексу II/III.
Оскільки COQ9 бере участь у біосинтезі CoQ 10, загальну кількість CoQ10 вимірювали за допомогою надвисокої продуктивності рідинної хроматографії у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (UPLC-MS/MS). Обидві клітинні лінії пацієнтів CoQ 10 продемонстрували значно знижений рівень CoQ 10, з 10 пмоль/мг білка у фібробластах варіанта COQ2 та 7,3 пмоль/мг білка у фібробластах варіанту COQ9 (нормальний діапазон 46, 5-90, 5 пмоль/мг білка). Після трансдукції мутантні фібробласти COQ9 продемонстрували значне (приблизно в 3 рази) збільшення рівнів CoQ 10, тоді як рівні CoQ 10 залишалися незмінними в мутантних клітинах COQ2 (рис. 2b). Ці висновки є свідченням причинно-наслідкового зв’язку між виявленим варіантом COQ9, дефіцитом CoQ 10 та зниженою активністю комплексу II/III.
Дослідження на моделі миші та недавні дослідження на людях показали, що COQ9 - це ліпідозв’язуючий білок, який має структурну гомологію до сімейства TFR (бактеріальні регулятори транскрипції). 9, 11 Lohman et al. 9 продемонстрував, що COQ9 навряд чи буде діяти як фактор транскрипції, і припустив, що структурний компонент TFR повторюється під час еволюції. Замість того, щоб каталізувати конкретну реакцію біосинтезу лише CoQ10, припускають, що COQ9 зв'язується або з CoQ 10, або з попередником CoQ 10 і утворює комплекс із COQ7. COQ7 каталізує гідроксилювання 6-деметокси-CoQ10, що є попереднім етапом біосинтезу CoQ. Помітно знижена кількість COQ7 у клітинній лінії пацієнта, яка врятовується збільшенням COQ9, вказує на функцію COQ9-стабілізуючу COQ7 (рис. 1в).
Слід зазначити, що потенційний проміжний продукт біосинтезу CoQ10 був описаний у мишей-мутантів COQ9, а також у фібробластів людини. 6, 11 У мишей цей метаболіт ідентифікували як 6-деметокси-убіхінон 9. Детальних досліджень на людях досі бракує. Для характеристики метаболіту в клітинах людини ми виконали різні аналітичні методи UPLC-ESI-MS/MS, такі як сканування, сканування іонів-попередників або режим контролю множинних реакцій. Відповідно до досліджень на мишах, ми спеціально виявили 6-деметокси-убіхінон 10 у фібробластах COQ9 (рис. 2в та г). Оскільки 6-деметокси-убіхінон 10 є гідроксильованим COQ7, утворюючи 6-гідрокси-убіхінон 10, накопичення цього проміжного продукту можна пояснити зменшеною кількістю COQ7. 9 Як і очікувалося, експресія COQ9 нормалізувала рівні COQ7 та 6-деметокси-убіхінону 10 (рис. 2г). Метаболіт не був виявлений в інших клітинних лініях.
Добавки CoQ 10 корисні у деяких пацієнтів із дефіцитом CoQ 10. Щоб перевірити ефект лікування в наших клітинних лініях, ми доповнили їх 5 мкМ CoQ 10 протягом 1 тижня згідно з Lopez et al. 12 лікування CoQ 10 врятувало активність комплексу II/III у фібробластах мутантних мутантів COQ9 значно до -80% найнижчого контрольного значення (рис. 2д). Майже такий самий ефект спостерігався у COQ2-мутантних фібробластів, тоді як ніяких відмінностей не вимірювали в контрольних фібробластах. Вміст CoQ 10 у фібробластах пацієнтів значно збільшився приблизно до 11 разів після лікування та досяг контрольних значень (рис. 2b). Цікаво, що у пацієнтів з фібробластами з генетичним дефектом COQ9 після лікування CoQ 10 не було виявлено 6-деметокси-убіхінону 10, що може бути пов’язано зі зменшенням ендогенного біосинтезу шляхом достатнього екзогенного додавання CoQ 10 (рис. 2г).
Нарешті, наше дослідження надає подальші уявлення про клінічні та клітинні наслідки дефіциту COQ9. Важкий клінічний перебіг, який спостерігається у нашого пацієнта, свідчить про критичну функцію COQ9 вже під час пренатального розвитку. Випадок, разом з описом Duncan et al., Ставить дефіцит COQ9 серед найсерйозніших форм порушень метаболізму CoQ 10, порівнянний із описаним у пацієнтів із порушеннями COQ2 або COQ4. Однак для оцінки конкретного клінічного спектру пацієнтів з мутаціями COQ9 будуть потрібні подальші клінічні описи. Як пропонують Duncan et al. 6 Лікування CoQ 10 може бути корисним у дітей з дефіцитом COQ9. Тому у незрозумілих випадках мітохондріальної хвороби новонароджених/раннього дитинства рекомендується емпіричне лікування CoQ 10. .