UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Факультет ветеринарної медицини Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis у видимо здорових собак та кліщів з чотирьох муніципалітетів на заході Куби Дисертація як варіант для наукового ступеня доктора ветеринарних наук Автор: DMV Maylín González Navarrete, M. Sc Mayabeque, 2018

здорових

UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Факультет ветеринарної медицини Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis у очевидно здорових собак та кліщів з чотирьох муніципалітетів на заході Куби Дисертація як варіант для наукового ступеня доктора ветеринарних наук Автор: DMV Maylín González Navarrete, M. Scutors: DMV Adivaldo Henrique Da Fonseca, Dr. C. DMV Eugenio Roque López, Dr. C. Advisors: DMV María Antonia Abeledo García, Dr. C. Lic. Belkis Corona González, Dr. C. Mayabeque, 2018

Присвята Усім нам, хто мріє зберегти збереження, щоб зберегти цілісність природи та тварин як її частини. Усім нам, хто не перестає мріяти, битися, розслідувати і завжди шукає найкращий спосіб зберегти себе. До нових поколінь, яких ми зобов’язані шанувати своєю працею та керівництвом, готуючись до кожного дня, щоб наш приклад був найкращим способом навчання.

Табличний індекс Таблиця 1. Розширення поверхні, щільність населення та щільність собак у виборчих муніципалітетах. 38 Таблиця 2. Кількість сумішей кліщів відповідно до стадії від кожного муніципалітету. 41 Таблиця 3. Праймери, що використовуються для виявлення E. canis методом вкладеної ПЛР. 42 Таблиця 4. Графіки ампліфікації для кожного вкладеного аналізу ПЛР (Murphy et al., 1998). 43 Таблиця 5. Відсоток собак з антитілами IgG проти E. canis відповідно до віку, породи та статі. 56 Таблиця 6. Кількість собак і будинків, відібраних за місцевістю. Розподіл вибіркових будинків відповідно до кількості собак на будинок. 60 Таблиця 7. Кількість зібраних кліщів та собак, заражених муніципалітетом. 65 Таблиця 8. Класифікація інтенсивності зараження R. sanguineus s.l. у відібраних собак. 70 Таблиця 9. Ступінь зараженості R. sanguineus s.l. в муніципалітетах, що вивчаються. 70 Таблиця 10. Взаємозв'язок змінних та позитивність до E. canis шляхом вкладеного ПЛР у чотирьох муніципалітетах західного регіону Куби (одновимірна логістична регресія). 86 Таблиця 11. Фактори ризику, пов’язані з позитивністю до E. canis шляхом вкладеного ПЛР у чотирьох муніципалітетах західного регіону Куби. (Багатовимірна логістична регресія). 87

100 б.п. (Промега, Медісон, США); Рядки 2 і 3: негативний контроль; Рядки 4-15: суміші ДНК кліщів, Рядок 16: позитивний контроль. 77 Рисунок 15. Відсоток собак, відібраних за віковою категорією. 84

Список абревіатур, абревіатур та символів ДНК: дезоксирибонуклеїнова кислота Ca Cl2: хлорид кальцію dntps: дезоксирибонуклеотид трифосфати EDTA: етилендіамінтетраоцтова кислота ІФА: непрямий імуноферментний аналіз IFI: непряма імунофлоресценція хлорид хлорид мг хлорид мг мг мілілітр мм: мілімолярний АБО: співвідношення шансів pb: пари основ PBST: забуференний фосфатом фізіологічний розчин pH 7,2-7,4 з 5% Tween 20 PBS: забуференний фосфатом сольовий розчин ПЛР: полімеразна ланцюгова реакція ph: Гідрогенний потенціал pmol: пікомоль рРНК: рибосомна рибонуклеїнова кислота rpm: оборотів в хвилину TAE: буфер трис-ацетат-ЕДТА Taq: фермент ДНК-полімерази, виділений з бактерії Thermus aquaticus U: одиниця V: вольт мкг: мікрограм мкл: мікролітр мкм: мікромолярна 16S ррна: 16S порція рибосомної РНК: Торгова марка C: Цельсій сорт

ЗАГАЛЬНИЙ ПОКАЗНИК ВСТУП. 2 Гіпотеза. 5 Загальна мета. 5 Конкретні цілі. 5 НАУКОВА НОВИНА І ВНОС. 7 РОЗДІЛ I. БІБЛІОГРАФІЧНИЙ ОГЛЯД. 8 1.1. Поняття та історія моноцитарного ерліхіозу собак. 8 1.2. Етіологічний агент. 9 1.2.1. Таксономія E. canis. 10 1.2.2. Морфологія. 10 1.3. Епідеміологія собачого ерліхіозу. 11 1.3.1. Географічне поширення E. canis. 11 1.3.2. Вектори. 12 1.3.3. Ведучі. 19 1.3.4. Передача E. canis. 20 1.3.5. Фактори ризику, пов'язані з інфекцією E. canis. 21 1.4. Патогенез собачого ерліхіозу. 23 1.4.1. Клінічна картина. 25 1.5. Діагностика E. canis. 27 1.5.1. Діагностика за допомогою мазка крові. 28 1.5.2. Культура клітин. 29 1.5.3. Серологічний діагноз. 30 1.5.4. Молекулярна діагностика за допомогою полімеразної ланцюгової реакції у господаря. 31 1.5.5. Молекулярне виявлення у векторі. 32 1.5.6. Диференціальна діагностика. 33 1.5.7. Множинні інфекції або супутні інфекції. 33 1.6. Профілактика та боротьба з ерліхіозом собак. 34 1.6.1. Профілактика. 34 1.6.2. Боротьба з кліщем R. sanguineus. 35 РОЗДІЛ II. МАТЕРІАЛИ І ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИ. 38

4.3.5. Ідентифікація будинків із собаками, зараженими R. sanguineus s.l. 71 4.2.4. Часткові висновки. 73 РОЗДІЛ V. Ehrlichia canis у кліщів, зібраних у собак, відібраних у досліджуваних муніципалітетах. 75 5.1. Вступ. 75 5.2. Матеріали і методи. 76 5.2.1. Збір та збереження кліщів. 76 5.2.2. Аналіз вкладеної ПЛР. 76 5.2.3. Послідовність та аналіз ампліфікованих фрагментів. 76 5.3. Результати і обговорення. 76 5.4. Частковий висновок. 79 РОЗДІЛ VI. Фактори ризику, пов'язані з Ehrlichia canis, у зовні здорових собак, які проживають у муніципалітетах Хабана-дель-Есте, Боєрос, Которро та Сан-Хосе-де-лас-Лахас. 81 6.1. Вступ. 81 6.2. Матеріали і методи. 82 6.2.1. Характеристика вибіркової сукупності. 82 6.2.2. Епідеміологічна анкета. 82 6.2.3. Статистичний аналіз. 83 6.3. Результати і обговорення. 83 6.3.1. Характеристика вибірки популяції собак. 83 6.3.2. Аналіз факторів ризику. 85 6.4. Частковий висновок. 91 РОЗДІЛ VII. Загальна дискусія. 92 VIII. ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ. 98 IX. РЕКОМЕНДАЦІЇ. 100 X. БІБЛІОГРАФІЧНА ЛІТЕРАТУРА. 1 IX. ДОДАТКИ. 1

Вступ 4. Визначте фактори ризику, пов'язані з інфекцією E. canis, у здорових домашніх собак, що здаються здоровими у досліджуваних муніципалітетах. 6

Вступ НАУКОВА НОВИНКА І ВНОС Присутність E. canis вперше продемонстровано на Кубі у зразках крові від, здавалося б, здорових собак із доміциляцією та їх кліщів. Про спільне зараження E. canis та A. platys свідчить спостереження мазків крові. Це дослідження робить важливий внесок у епідеміологію ерліхіозу собак на Кубі, що дозволить приймати рішення та встановлювати майбутні трансдисциплінарні та багатогалузеві стратегії профілактики та контролю захворювання 7

Глава I. Бібліографічний огляд 1.3.2.1. Біологічний цикл R. sanguineus Біологічним циклом кліща R. sanguineus є триоксен (рис. 1), тому кліщу для завершення циклу потрібні три господарі, які є господарями для кожної стадії, і всі линьки виробляються в навколишньому середовищі (ESCCAP, 2016). Рисунок 1. Біологічний цикл кліща R. sanguineus, кліща trioxena (Чавес, 2014) Тривалість біологічного циклу кліща R. sanguineus залежить від факторів навколишнього середовища, таких як температура та вологість (Estrada-Peña, 2015). Інкубаційний період яєць та перетворення личинок у німф, а з них у дорослих особин, є оптимальним у діапазоні між 25-30 С та відносною вологістю у значно ширшому діапазоні (35-95%), тоді як вони подовжуються, якщо температура нижній. В ідеальних умовах тропічного клімату кліщі залишаються активними протягом усього року, і їх можна спостерігати від трьох до чотирьох поколінь на рік (Dantas-Torres, 2010; León, 2011; Rubio et al., 2015). 14

ЗАГАЛЬНІ МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Розділ II. Загальні матеріали та методи РОЗДІЛ II. МАТЕРІАЛИ І ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИ 2.1. Тип дослідження та область вибірки Описове поперечне дослідження ерліхіозу собак було проведено в трьох муніципалітетах провінції Гавана та одному з провінцій Маябеке протягом періоду з вересня 2013 року по серпень 2014 року (таблиця 1). Таблиця 1. Розширення поверхні, щільність населення та щільність собак у виборочних містах. Провінція Гавана, провінції Маябеке, вибірки Площа поверхні (км 2) Щільність популяції (заселення/км 2) Розрахункова популяція собак Хабана-дель-Есте 141,5 1247,3 17649 Собаки великої рогатої худоби 134,8 1438,6 19392 Которро 65,9 1207,7 7959 Сан-Хосе-де-лас-Лахас 593,0 125,2 7424 Критерії включення муніципалітети мали легкий доступ та можливість контакту з заводчиками та ветеринарами; ще й тому, що вони є периферійними муніципалітетами провінції Гавана з більшим поверхневим розширенням і мають міську та сільську частини. Сан-Хосе-де-лас-Лахас був обраний муніципалітетом з найбільшою площею в провінції Маябеке (рис. 3). 38

Розділ II. Загальні матеріали та методи Послідовності консенсусу, генеровані з репрезентативними нуклеотидними послідовностями гена 16S рРНК E. canis, доступні в базі даних GenBank. Зразки були направлені на секвенування до Центру досліджень геному та стовбурових клітин людини, сектору секвенування ДНК Університету Сан-Паулу, Бразилія. 2.10. Статистичний аналіз Дані були складені в таблиці, оброблені та відображені в програмі Microsoft Office Excel 2016. Проведено порівняння кількох пропорцій, і для цього використана програма CompaProWin_2.0.1, а також метод порівняння Уолда шляхом корекції (Castillo and Miranda, 2014). Для цілей дослідження було враховано рівень довіри 95%. Результати були представлені в таблицях та графіках для кращого аналізу та розуміння. 44

Розділ III Таблиця 6. Кількість собак та будинків, відібраних за місцевістю. Розподіл вибіркових будинків відповідно до кількості собак на будинок. Муніципалітети Всього собак Загальна кількість відібраних будинків Розподіл вибіркових будинків відповідно до кількості собак на будинок Один собака Два-три Більше трьох собак Хабана дель Есте 104 73 54 16 3 Боєрос 102 82 67 11 4 Которро 82 49 29 12 8 Сан-Хосе de las Lajas 90 46 29 9 8 Всього 378 250 179 48 23 У 56,40% (141/250) будинків наявність позитивних собак на E. canis діагностували за допомогою вкладеного ПЛР-тесту. Що стосується загальної кількості будинків на муніципалітет з позитивними собаками, відсотки показують ще більш тривожну ситуацію, причому муніципалітет Боєрос виділяється найбільшим значенням (69,51%), суттєво відрізняючись від відсотків, виявлених у муніципалітетах Которро та Сан-Хосе. las Lajas (рис. 10). 60

Розділ III 35/73 (47.94b) 25/46 (54.35ab) 57/82 (69.51a) 24/49 (48.97b) Сан. Хосе де лас Лахас. Которро. Боєрос. Східна Гавана. Різні літери суттєво різняться (Р 0,05) Рисунок 10. Відсоток будинків з позитивними собаками E. canis, яким діагностували гніздову ПЛР. Ці результати показують, що високий відсоток людей у ​​чотирьох розслідуваних муніципалітетах живе з собаками, які є позитивними на E. canis, що є попередженням, враховуючи зоонозний потенціал цього збудника (Pérez et al., 2006). У Венесуелі Перес та ін. (1996) отримали ізолят E. canis з культури крові безсимптомної людини. У цій самій країні через десять років ДНК цієї рикетсії була ампліфікована у шести людей з клінічними ознаками моноцитарного ерліхіозу (Pérez et al., 2006), а нещодавно новий генотип E. canis був виявлений у зразках крові, отриманих у банках крові в Коста-Ріці (Bouza-Mora et al. 2017). 61

Розділ III 3.3.5. Були виявлені часткові висновки Morulae, сумісних з E. canis та коінфекцією A. platys, що збільшує вираженість клінічної картини та можливий діагноз інфекційного процесу. Високий відсоток видимо здорових доміциліарних собак, заражених E. canis, був продемонстрований у зразках крові цих собак методом гніздової ПЛР. Високий відсоток будинків у муніципалітеті з собаками, позитивно сприйнятими E. canis, що мешкають разом із власниками, становить ризик зараження цим збудником для людини. 62

РОЗДІЛ IV види під назвою R. sanguineus s.l., кількість побратимів яких у всьому світі ще не визначена. Ця гіпотеза передбачає, що таксономічний статус кубинської R. sanguineus може потребувати перегляду (Gray et al., 2013; Dantas-Torres and Otranto, 2015; Nava et al., 2015) на Карибських островах, таких як Гранада, Тринідад, Сент. Кіттс і Невіс, Мартініка, Аруба, Пуерто-Рико та Гаїті повідомляють про високу частоту появи цього виду кліщів у собак (Yabsley et al., 2008; Asgarali et al., 2012; Kelly et al., 2013; Loftis et al. . al., 2013; Starkey et al., 2016). А Б В Г Рисунок 11. Морфологія кліща R. sanguineus s.l. Чоловічий вентральний (A) і спинний (B) вигляд. Жіночий черевний (C) і спинний (D) вид. 66

РОЗДІЛ IV 160 140 120 100 80 60 40 20 0 95 84 48 44 48 23 8 158 153 47 16 24 14 16 2 0 0 9 0 Імаго чоловік Імаго самка Німфи Личинки Всього Хабана дель Есте Боєрос Которро Сан Хосе де лас Лахас 73 Рисунок 12 Відсоток стадій та статі кліщів R. sanguineus sl у заражених собак. Переважали стадії чоловічого імаго, а потім імаго жіночого, стадія личинки становить найменше значення. Подібна поведінка мала місце у чотирьох досліджуваних муніципалітетах. Результати можуть бути пов’язані зі швидкістю осипання кліщів від хазяїна та часом, коли проводились відбір проб, коли личинки виду R. sanguineus демонструють характер осипання переважно протягом дня. На відміну від них, німфи та грубі самки линяють переважно вночі (Dantas-Torres, 2010). Той факт, що стадія імаго у чоловіків переважала над іншими стадіями, є актуальним, оскільки він відіграє важливу роль у передачі E. canis. Бремер та співавт. (2005) показали, що самці можуть харчуватися кілька разів за відсутності самки кліща, і в цьому процесі можуть набувати та передавати E. canis. 68

РОЗДІЛ IV Значення поширеності кліщів у собак можуть змінюватися в залежності від щільності популяції собак, частки собак, які отримували ектопаразитики або репеленти проти кліщів, а також окремих факторів, таких як порода, вік та спосіб життя тварини. Варіабельність значень ступеня інвазії, що сталася в муніципалітетах, розслідуваних на користь Боєроса, може бути пов'язана із способом життя, якому вони піддаються власники, де 52% собак утримувались вільними або напівзміщений Без контролю або обмеження за часом це сприяє контакту з іншими собаками та впливу кліщів (Azevedo et al., 2011; Cardoso et al., 2012). У цьому муніципалітеті 66,70% (66/102) собак були в категорії 2 роки і> 10 років, з них 57,57% (38/66) були заражені кліщами, тоді як 35, 29% (36/102) були у категорії