предметів

реферат

Дитяче ожиріння відповідає збільшенню кількості циркулюючих класичних CD14 + CD16 - та помірних CD14 + CD16 + моноцитів. Моноцити є ключовими гравцями розвитку та загострення атеросклерозу, що ставить питання про те, чи сприяв моноцитоз при ожирінні у дітей протягом багатьох років атерогенезу. Тут ми обговорили профіль експресії гена моноцитів при ожирінні у дітей за допомогою платформи мікрочипів Illumina на сортованих моноцитах 35 дітей із ожирінням та 16 поганих контрольних груп. Діти, що страждають ожирінням, показали сильний профіль експресії генів моноцитів у порівнянні з худими контролями. Після валідації за допомогою кількісної ПЛР ми вивчили зв'язок 5 найкращих диференційовано регульованих генів моноцитів при ожирінні у дітей із ожирінням та складністю коронарного атеросклерозу (оцінка SYNTAX) у групі з 351 дорослого з ризиком розвитку ішемічної серцево-судинної патології. Зниження рівня моноцитів IMPDH2 та TMEM134 при ожирінні у дітей також спостерігалося у дорослих із ожирінням. Крім того, зниження регуляції моноциту TMEM134 було пов’язане з вищим показником атеросклерозу SYNTAX у дорослих. На закінчення, ожиріння у дітей включає зміни в експресії гена моноцитів, пов’язані з ожирінням та збільшенням складності коронарного атеросклерозу у дорослих.

Епідемія ожиріння у дітей має тривожні серцево-судинні наслідки і, таким чином, обмежує всесвітнє збільшення тривалості життя 1, 2. Раннє ожиріння може сприяти розвитку серцево-судинних захворювань кількома способами. По-перше, дитяче ожиріння, як правило, призводить до ожиріння у зрілому віці, що є важливим фактором ризику серцево-судинних захворювань, особливо ожиріння вісцеральної системи 3, 4. По-друге, ожиріння серед дітей та дорослих має спільні незалежні фактори ризику серцево-судинних захворювань, такі як високий кров'яний тиск 5. Крім того, індукована ожирінням резистентність до інсуліну та гіперглікемія призводять до дефектної сигналізації інсуліну в клітинах ураження судинної стінки, що сприяє розвитку атеросклерозу на рівні артеріальної стінки 6. Нарешті, ожиріння пов'язане з низьким рівнем системного запалення, що сприяє атерогенезу 7, 8 .

На клітинному рівні моноцити виявляються ключовим ланкою між ожирінням та серцево-судинними захворюваннями. Ожиріння супроводжується лейкоцитозом, особливо мієлоїдної лінії 7, 9. Недавні дослідження показують, що похідні з жирової тканини фактори запалення, такі як IL-1β, стимулюють мієлоїдні попередники кісткового мозку, що призводить до моноцитозу при ожирінні 10. Окрім підвищеної кількості моноцитів, при ожирінні спостерігається активований та запальний фенотип. У людини моноцити поділяються на три фенотипові категорії: класичний CD14 + CD16-, проміжний CD14 + CD16 + та некласичний CD14 + CD16 + моноцити 11. Раніше ми вже показали, що ожиріння у дітей супроводжується збільшенням кількості та активованим фенотипом класичної CD14 + CD16 - моноцитарної підгрупи 7. Ці моноцити еквівалентні моноцитам з високим вмістом GR1 + Ly6c у мишей, які диференціюються у запальні макрофаги та пінопластові клітини на різних моделях атеросклерозу 12, 13. Таким чином, збільшення кількості запальних моноцитів при ожирінні у дітей може сприяти розвитку атерогенезу протягом багатьох років.

Метою цього дослідження було глибше зрозуміти профіль експресії гена моноцитів при ожирінні у дітей у порівнянні з контролем нормальної ваги за допомогою аналізу мікронарізів сортованих моноцитів. Далі профілі експресії генів моноцитів порівнювали із встановленою когортою з 351 дорослої людини з ризиком розвитку ішемічної серцево-судинної хвороби, щоб визначити, чи перекриваються профілі експресії генів моноцитів при ожирінні у дітей із атерогенним фенотипом моноцитів у дорослих. Когорта дорослих включала кілька клінічних параметрів, але ми зосередили увагу на взаємозв'язку між експресією гена моноцитів та показниками атеросклерозу SYNTAX, оскільки це встановлена ​​ангіографічна система оцінки складності коронарних атеросклеротичних уражень, яка широко використовується як показання атеросклеротичного навантаження., 17, 18 .

результат

Моноцити при ожирінні у дітей мають сильний профіль експресії генів

Діти з ожирінням показали типові клінічні та біохімічні характеристики із значно вищим стандартним відхиленням індексу маси тіла за віком та статтю (ІМТ-СД) порівняно з худими контролями (3, 4 проти 0,4, р 109/мл проти 0,4 х 109/мл p + CD16 - моноцити (52,0 × 107/мл проти 36,2 х 107/мл, p = 0,001) і вище середнє значення CD14 + CD16 + моноцити (4,6 х 107/мл проти 3,3 х 107/мл, р

моноцитів

Теплова карта та кластерний аналіз експресії гена моноцитів. Теплова карта показує структуру кластера генів як ієрархічне дерево з різними гілками і використовує z-оцінки рядків для відображення даних, які відрізняються вище або нижче середнього показника популяції.

Повнорозмірне зображення

Кількісне підтвердження ПЛР

Кількісна ПЛР (qPCR) була використана для підтвердження результатів експресії генів з акцентом на перших 20 втручаннях в мікрочипи. QPCR-аналізи підтвердили спостережену знижену регуляцію генів моноцитів: гідроксиметилбілансинтаза (HMBS) (p = 0,01), багата на лейцин пентатрикопептид, що містить повтор (LRPPRC) (p = 0,005), трансмембранний білок 134 (TMEM134) (p = 0,028) та Zwilch Protein Kineto (ZWILCH) (p = 0,005) при ожирінні у дітей у порівнянні з худими контролями (рис. 2, додаткова таблиця 7). Крім того, інозинмонофосфатдегідрогеназа 2 (IMPDH2) продемонструвала тенденцію до зниження регуляції в моноцитах із ожирінням (р = 0,06). Через значну знижену регуляцію моноцитів у дорослих із ожирінням, IMPDH2 також був включений у подальші аналізи. Разом ці 5 знижених регуляції генів сформували вихідну точку для подальших досліджень. Спочатку було досліджено зв'язок між 5 регульованими генами моноцитів та відбором клінічних змінних у дитячому віці (Додаткові таблиці 3 та 4). По-друге, взаємозв'язок із ожирінням та атеросклерозом вивчали у дорослих із ризиком ішемічної серцево-судинної патології.

Кількісна ПЛР підтверджує зниження регуляції 5 генів моноцитів при ожирінні у дітей. Графіки показують багаторазову індукцію бажаного гена, нормалізовану для експресії гена. Смужки помилок представляють SEM.

Повнорозмірне зображення

Аналіз треків

Зосередивши увагу на функціональній відповідності спостережуваного профілю експресії генів, функціональне збагачення диференційовано експресованих генів у біологічних процесах оцінювали за допомогою інструменту ToppFun, інструменту збагачення термінів GO. Шістдесят чотири з 67 генів можна було ідентифікувати за допомогою ToppFun і відобразити на шляхи, задіяні в біологічних процесах, використовуючи мінімальний розмір шляху 10 генів. Ці гени головним чином брали участь у окисному фосфорилюванні та різних метаболічних процесах (Додаткова таблиця 5, Додаткова фігура 1).

Експресія гена моноцитів та ожиріння дорослих та серцево-судинний ризик

Щоб визначити, чи мають дорослі групи ризику профіль експресії гена моноцитів, подібний до дітей, що страждають ожирінням, у групі з 351 дорослого з ризиком розвитку ішемічної серцево-судинної хвороби вивчали 5 перевірених генів моноцитів. Клінічні характеристики когорти дорослих перелічені в додатковій таблиці 8.

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

обговорення

Наші результати підкреслюють важливість моноцитозу в дитячому ожирінні та порушують кілька цікавих питань. По-перше, аналіз шляху диференційовано регульованих генів моноцитів при ожирінні у дітей виявив надмірну кількість окисного фосфорилювання, окисного стресу та внутрішньоклітинних метаболічних шляхів, очевидно, відображаючи перепрограмування на аеробний гліколіз. У той час як імунні клітини, що відпочивають, перш за все потребують АТФ для задоволення клітинних потреб, а для задоволення цих потреб використовують перетворення глюкози та пірувату (гліколіз) та окисне фосфорилювання, багато імунні клітини в запальних мікросередовищах переробляють метаболічне перепрограмування на аеробний гліколіз для участі в рості та проліферації. 23. Цікаво, що підвищення регуляції аеробного гліколізу також збігається з розвитком "тренованого імунітету" 24. При повторній стимуляції мікробними фрагментами та/або метаболітами моноцити піддаються епігенетичному перепрограмуванню на аеробний гліколіз, що збільшує реакцію тренованих моноцитів на рестимуляцію 23, 25. Недавня література свідчить, що розвиток тренованого імунітету сприяє розвитку системного запалення та атеросклерозу і представляє цікаву мішень для терапевтичного втручання 25 .

По-друге, роль TMEM134 у моноцитах набуває все більшої популярності. У дослідженнях моноцитів людини експресія TMEM134 була знижена у класичних CD14 + CD16- та проміжних CD14 + CD16 + моноцитів, на відміну від некласичних CD14 + CD16 + моноцитів 26. Таким чином, знижена регуляція TMEM134 при ожирінні у дітей та дорослих із серцево-судинним ризиком може відображати CD14 + CD16 + та CD14 + CD16 +, спричинене CD14 + ожирінням. Потрібно уточнити, чи відіграє активну роль висококонсервований трансмембранний білок TMEM134 21,5 кДа у диференціації моноцитів. Існуючі дослідження показують, що TMEM134 впливає на прототип сигнального шляху запального ядерного фактора KB (NF-κB). TMEM 134 був ідентифікований як зв'язуючий білок латентного мембранного білка 1 (LMP1) та відкритої рамки зчитування вірусу гепатиту Е 2 (ORF2) і впливав на передачу сигналів NF-κB через цих партнерів 27, 28 Важливо, що модуляція передачі сигналів NF-κB нижче за течією вважається однією з ознак вродженого імунного програмування при хронічному запаленні 29. Тому спокусливо припустити, що спостерігається зниження регуляції TMEM134 у дитячих моноцитів ожиріння пов'язане з розвитком тренованого імунітету, як обговорювалося вище.

Нарешті, слід взяти до уваги обмеження поточного дослідження. Оскільки наша популяція педіатричних досліджень була відносно невеликою, асоціації, про які повідомляється в нашому дослідженні, мають незначну силу. По-друге, фактори навколишнього середовища, такі як заморожування та розморожування моноцитів, можуть вплинути на профілі експресії генів. Хоча до педіатричних та дорослих зразків ставилися однаково, незначні відмінності в обробці можуть впливати на профілі експресії генів. По-третє, ми вирішили зосередитись на 5 генах моноцитів, підтверджених qPCR. Тому ми могли б ігнорувати важливі гени моноцитів, які не були включені в перевірку qPCR. Нарешті, сортування CD14-позитивних магнітних гранул відхилило аналізовані відділи моноцитів до класичних CD14 + CD16- та проміжних моноцитів CD14 + CD16 + (додаткова фігура 2) і частково не вдалося врахувати некласичні підмножини CD14 + CD16 +, що є вважається менш важливим для розвитку атеросклерозу 21, 22 .

На закінчення, ожиріння у дітей включає зміни в експресії генів моноцитів, пов’язані з ожирінням, та підвищену складність коронарного атеросклерозу у дорослих. Зокрема, роль TMEM134 у моноцитах набуває популярності, оскільки зниження регуляції моноцитів TMEM134 асоціювалось із ожирінням у дітей та дорослих та збігалось у часі з вищим показником атеросклерозу SYNTAX у дорослих із ризиком ішемічної серцево-судинної патології.

методи

Дитяча когорта

Одноядерні клітини периферичної крові (PBMC) вивчали у 51 дитини віком 6-16 років (35 ожиріння, 16 поганого контролю). Клітини були отримані в результаті раніше опублікованого дослідження поперечного перерізу в дитячому амбулаторному відділенні Медичного центру Меандр в Амерсфорті, Нідерланди, яке включало 60 дітей із ожирінням та 30 контрольних груп за віком та статтю 7. Оскільки PBMC були доступні для 35 дітей із ожирінням та 16 поганих груп контролю, ці діти були включені в поточне дослідження. Важливо, що доступність збережених PBMC залежала від кількості крові, яку пацієнт здав після зарахування, і яка випадково змінювалася. Тому ми вважаємо, що пацієнти в поточному дослідженні рандомізовані до попереднього дослідження.

ІМТ-SD був розрахований на основі результатів П’ятого дослідження голландського зростання (2008-2010 рр.). Дитяче ожиріння визначали як ІМТ-SD> 2,5, що можна екстраполювати до міжнародного визначення ожиріння як ІМТ> 30 кг/м2 для дорослих 30, 31. Артеріальний тиск вимірювали за допомогою автоматизованого осцилометричного методу (Dinamap; GE Healthcare, Amersham, Великобританія). Ліпідні профілі отримують за допомогою стандартизованих лабораторних процедур. Письмова інформована згода була отримана від усіх дітей та їх батьків. Дослідження було схвалено Інституційною комісією з огляду медичної етики Університетського медичного центру Утрехт, Нідерланди. Всі експерименти з біологічними матеріалами людини проводились відповідно до діючих настанов та норм.

Доросла група

моноцити

Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) виділяли в обох когортах за допомогою центрифугування з градієнтом щільності Ficoll-Paque. У дитячій когорті в попередніх дослідженнях проводили фенотипування проточної цитометрії 7. Після виділення зразки зберігали в морозильному середовищі (FCS з 10% DMSO, Sigma-Aldrich) до подальшого використання. Для виділення моноцитів збережені зразки розморожували та промивали у середовищі, що містить RPMI1640, доповненому 1-глутаматом та 25 мМ HEPES (Gibco), що містить 2% FCS та пеніциліну/стрептоміцину (100 Од/мл) (Invitrogen). Клітини, де центрифугували протягом 10 хвилин, 1600 об/хв при кімнатній температурі. Потім PBMC ресуспендували в буфері MACS - 2% FBS (Biowest), 2% EDTA (хімічні речовини VWR) у PBS (Gibco) - і підраховували, використовуючи метод виключення трипанового синього (Gibco). Магнітні частинки CD14 проти людини, де вони згодом використовуються для виділення моноцитів за допомогою корпоративного протоколу (BD IMag). Потім CD14-позитивні клітини ресуспендували в 500 мкл TRIZOL (Life Technologies) і зберігали при -80 ° C.

Мікрочипи та обробка даних

РНК виділяли із тризольованих зразків прикладної біотехнології AROS. Зразки від 35 дітей, що страждають ожирінням, та 16 здорових контрольних дітей та 351 дорослих проходили ті самі процедури ізоляції та обробляли подібним чином. Коротко, зразки маркували за допомогою набору для ампліфікації РНК Illumina TotalPrep та 100 нг загальної РНК. Продукт IVT перевіряли гелем та кількісно визначали за допомогою NanoDrop (Thermo Scientific). 750 нг кДНК використовували для стандартного протоколу Illumina перед тим, як зразки були гібридизовані на полях (Illumina humanHT-12 v3). Поля сканували за допомогою зчитувача масивів бісеру (Illumina). Після перевірки середньої інтенсивності зразків відбирали зразки із середньою інтенсивністю 33 .

qPCR перевірка

Для перевірки 67 диференційовано експресованих генів були розроблені праймери qPCR для 20 найкращих звернень. З цих пар праймерів 17 функціонували оптимально і вважалися корисними для процесу перевірки (Додаткова таблиця 6). Для досліджень валідації qPCR була доступна високоякісна РНК для 27 дітей із ожирінням та 11 здорових контролів. Аналіз QPCR проводили з використанням реагентів SYBR Select Master Mix (Thermo Fischer Scientific) та запускали за допомогою системи QuantStudio Flex (Thermo Fischer Scientific). Дані були нормалізовані для експресії генів GUSB, 36B4 та B2M відповідно до міжнародних стандартів 34 .

статистика

По-перше, демографічні характеристики досліджуваної сукупності були представлені як цифри та відсотки для категоріальних змінних та як засоби із стандартним відхиленням (SD) або медіани з міжквартильними діапазонами (Q1, Q3) для нормальних та нормально розподілених безперервних змінних. Потім порівняли профілі експресії моноцитарних генів у бідних та дітей із ожирінням, а також суттєві відмінності між цими двома групами оцінювали за допомогою U-тестів Манна Уітні на безперервних змінних та тесту X2 на бінарних змінних.

По-друге, профілі експресії генів моноцитів порівнювали за допомогою пакету Limma у R. Коротко кажучи, пакет Limma використовує емпіричні методи Бейса для аналізу даних з мікрочипів експресії генів і спеціально розроблений для аналізу менших наборів даних 33. Для цього аналізу гени функціонували як вихідні змінні (залежні змінні), а статус ожиріння - як детермінанта (незалежна змінна). Вік і стать були включені в модель як коваріати. Крім того, корекція Бенджаміні Хохберга (BH) була використана для коригування для багаторазового тестування. Для ілюстрації результатів аналізу мікрочипів було створено теплову карту за допомогою функції теплової карти. 2 в R. Ієрархічна кластеризація виконана з використанням повного з'єднання.

По-третє, лінійна регресія була використана для вивчення взаємозв'язку між статусом ожиріння та експресією генів (залежна змінна). Для цього аналізу було побудовано дві моделі; необроблена модель (модель 1) та модель, у якій вік та стать були включені як коваріати (модель 2) (додаткова таблиця 2).

По-четверте, взаємозв'язок між 5 генами, підтвердженими qPCR, та клінічними змінними вивчався у всій педіатричній групі (n = 51), а також у підгрупі ожиріння (n = 35) та у групі дорослих (n = 351) за допомогою лінійних регресійний аналіз (додаткові таблиці 3 і 4). Для аналізу, проведеного протягом усього віку дитини, когорта, стать та ІМТ-СД були включені як коваріати, тоді як для аналізу у підгрупі віку та статі ожиріння були включені як коваріати. Р 2-сторонній