білка

  • предметів
  • реферат
  • Головний
  • результат
  • Генерація специфічних для епідермісу A20-дефіцитних мишей
  • Миші A20 EKO демонструють гіперплазію кератиноцитів
  • Миші A20 EKO демонструють відхилення в ектодермальних добавках
  • A20 діє як регулятор шляху EDA для активації NF-κB
  • обговорення
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова фігура 1
  • Документи Word
  • Додаткове зображення 1 Легенда
  • глосарій

предметів

реферат

Головний

Епідерміс складається в основному з кератиноцитів, розташованих у різні шари. Базальні кератиноцити є мітотично активними і забезпечують нові клітини, які поступово піддаються диференціюванню у напрямку до поверхні шкіри, де вони кукурудзяться і розщеплюються. Цей добре організований біологічний процес жорстко контролюється, і порушення послідовності подій може призвести до різних шкірних розладів, включаючи запалення та рак. Точний контроль транскрипційного фактора ядерного фактора KB (NF-kB) є важливим для підтримки гомеостазу шкіри, про що свідчить той факт, що надмірна активність NF-kB B, а також абляція основних активаторів NF-kB B призводять до запалення шкіри., 1, 2, 3 NF-kB належить до сімейства структурно споріднених та еволюційно збережених білків (p100 або NF-kB B2, p105 або NF-kB B1, p65 або RelA, RelB, c-Rel), які існують як гомо- або гетеродимери. У спокійних клітинах NF-κB підтримується неактивним шляхом зв’язування з білками-інгібіторами KB (IBB), з яких IκBa є найбільш вивченим. Численні подразники призводять до фосфорилювання та поліубіквітинації білків IκB, які спрямовують їх на протеасомну деградацію. Це призводить до вивільнення NF-κB, який накопичується в ядрі і транскрипційно активує гени-мішені.

Центральною подією в передачі сигналів NF-κB є активація комплексу IκB-кінази (IKK), який складається з двох кіназ, IKK1 та IKK2 (також відомих як IKK α та IKK β), та білка регуляторної платформи, NF-κ B основний модулятор (NEMO, також відомий як IKK γ). Експерименти, спрямовані на ген, показали, що IKK2 та NEMO, але не IKK1, необхідні для активації NF-kB B фактором некрозу пухлини (TNF) та Toll-подібними рецепторами. 3 Деякі рецептори, такі як лімфотоксин β і рецептори CD40, можуть активувати альтернативний шлях NF-κB, який включає IKK1 і призводить до переробки p100 NF-κB в p52, який утворює транскрипційно активний димер з RelB.

Оскільки NF-κB має вирішальне значення у розвитку та запаленні, необхідне суворе регулювання його активації. Цей суворий контроль досягається спільною дією позитивних і негативних регуляторів. В останні роки убіквітінація та деубіквітінація (DUB) декількох компонентів сигналізації NF-κB були визначені як основні етапи контролю шляхів передачі сигналів NF-κB. Одним із найважливіших гальмів щодо активації NF-κB є фермент убиквітину A20, який характеризувався як інгібітор активації NF-κB B та апоптозу. A20 необхідний для припинення передачі сигналів NF-κB у відповідь на TNF та мікробні продукти, такі як ліпополісахарид та мурамілдипептид. Важливість протизапальної активності A20 in vivo ілюструється сильним запаленням багатьох органів та перинатальною смертю, що спостерігається у мишей A20 -/-. Недавні генетичні дослідження демонструють зв'язок між геном гена білка 3, індукованим людським фактором A20/α (TNFAIP3), та аутоімунною патологією та псоріазом, припускаючи, що A20 може відігравати важливу роль в аутоімунних та запальних захворюваннях людини. Ці висновки підкреслюють важливість А20 у контролі нормального гомеостазу тканин і визначають його як потенційну мішень при лікуванні багатьох запальних патологій, включаючи псоріаз.

Ми використовували опосередкований К14/LoxP ген, націлений на мишей, для дослідження функції in vivo A20 в епідермальному розвитку та гомеостазі. Ми показуємо, що A20 є важливим для контролю проліферації кератиноцитів та для правильного розвитку ектодермальних міток. Наші дані свідчать про те, що специфічна для кератиноцитів делеція A20 призводить до EDA-A1-індукованої надмірної експресії NF-κB, що призводить до феноскопічних трансгенних мишей EDA-A1.

результат

Генерація специфічних для епідермісу A20-дефіцитних мишей

Для ідентифікації специфічних для тканин функцій A20 ми створили мишей, які несуть умовний алель A20, у яких екзони IV і V мишачого гена A20 фланковані сайтами LoxP. 26 Для вивчення функції A20 у дермальних та епідермальних добавках ми схрестили мишей A20 FL/FL з трансгенною лінією миші, яка експресує Cre під контролем промотора гена кератину 14 людини (K14-Cre). 27 Епідермальні миші, що нокаутують A20 з кератиноцитами (A20 EKO), народились із нормальною менделівською сегрегацією (дані не наведені). Щоб перевірити кератиноцитоспецифічну делецію A20 у мишей A20 EKO (рис. 1а), ми підтвердили аналізом Саузерн-блот, що рекомбінація, опосередкована Cre, була ефективною в епідермісі та первинних кератиноцитах (рис. 1b). В результаті ми не змогли виявити ендогенний A20 в епідермальних екстрактах мишей A20 EKO (рис. 1в).

Покоління мишей A20 ECO. a ) Фото миші A20 EKO та контрольної миші A20 FL/FL. ( b ) Саузерн-блот-аналіз ДНК епідермісу та дерми мишей A20 EKO та ДНК ізольованих кератиноцитів мишей A20 FL/FL (WT) та A20 EKO. ( c ) Екстракти епідермальних тканинних екстрактів, отримані з кератиноцитоспецифічних нокаутів (A20 EKO), аналізували методом вестерн-блот з використанням специфічних до A20 антитіл. Білкова смужка A20 позначена стрілкою, зірочка (*) позначає неспецифічні смуги

Повнорозмірне зображення

Миші A20 EKO демонструють гіперплазію кератиноцитів

У мишей A20 EKO не спостерігалося жодних макроскопічних ознак запалення шкіри, таких як почервоніння, лущення або надмірне подряпину через свербіж (рис. 1а). Гістологічний аналіз спинних ділянок шкіри показав посилений епідерміс через посилену проліферацію (в 2,5 рази) базальних клітин (рис. 2), але подібний дуже низький рівень апоптозу (дані не наведені). Структура експресії маркерів диференціації каспази-14, філагріну та кератину 10 була нормальною, а інфільтруючі імунні клітини не спостерігались (дані не наведені). Ці дані свідчать про те, що відсутність A20 не призводить до мимовільного запалення шкіри або що інші ферменти DUB, такі як циліндроматоз (CYLD), 28 діють надмірно, щоб запобігти мимовільному запаленню.

A20 EKO демонструє м’яку гіперпроліферацію кератиноцитів. ( a ) Частини спинної шкіри мишей A20 FL/FL та A20 EKO фарбували гематоксиліном та еозином та аналізували за допомогою світлової мікроскопії (масштаб: 100 мкм). ( b ) Ki-67-позитивне фарбування (темно-коричневі ядра) спинних ділянок шкіри від мишей A20 FL/FL та A20 EKO (стовпчик шкали: 100 мкм). ( c ) Кількісне визначення відсотка кі-67-позитивних кератиноцитів базального шару в частинах спинної шкіри мишей A20 FL/FL та A20 EKO.

Повнорозмірне зображення

Миші A20 EKO демонструють відхилення в ектодермальних добавках

Конверт мишей A20 EKO був дезорганізований (малюнки 1а та 3а). Цей фенотип кудлатого волосся ніколи не спостерігався в контрольних свердловинах A20 FL/FL. Мишей спостерігали до 12-місячного віку і не виявляли жодних ознак випадіння волосся або облисіння. Миші A20 FL/FL також перейшли на трансгенну лінію K5-Cre, 29, з якою спостерігався подібний фенотип (дані не наведені). Всі інші експерименти проводили на мишах A20 FL/FL/K14-Cre. 27

Миші A20 EKO мають тонше волосся з пошкодженою кутикулою. a ) Зображення шуби мишей AKO FL/FL та A20 EKO. ( b ) Волосся на спині мишей A20 FL/FL та A20 EKO епілювали. Мікроскопічне дослідження показує присутність у охоронних мишей A20 FL/FL волосся охоронців, хутряного волосся, кривого волосся та волосяного покриву. Миші A20 EKO мають лише пряме або кучеряве волосся. ах, слабке волосся; Au, Auchen волосся; gh, охоронне волосся; zz, криве хутро. ( c a d ) СЕМ-зображення волосся мишей A20 FL/FL та A20 EKO (стовпчик шкали: 10 мкм). ( e a f ) Зрізи ТЕМ через задню шкіру мишей A20 FL/FL та A20 EKO, що демонструють деталі ділянки волосяного фолікула (шкала: 500 нм). Миші A20 EKO мають гіперплазований та дезорганізований шкірний шар. h, стрижень волосся; в, кутикулярний шар

Повнорозмірне зображення

Інші особливості фенотипу A20 EKO, що фенотип EDA трансгени. a ) Зображення лап, яке спостерігається під бінокулярним мікроскопом, показує, що миші A20 EKO мають довші нігті, ніж контрольні посліди. ( b ) Макроскопічний аналіз хвоста показує більше хвилястих волосків хвоста та більші складки, подібні до мишей A20 EKO. ( c ) Себоцити на зрізах шкіри від A20 EKO та контрольних мишей фарбували анти-адипофіліновим антитілом. (Шкала: 500 мкм.) ( D ) Площі поверхонь зрізів через сальну залозу визначали на основі цього фарбування за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Volocity, і порівнювали середні площі поверхні у A20 EKO та контрольних мишей.

Повнорозмірне зображення

A20 діє як регулятор шляху EDA для активації NF-κB

Оскільки втрата A20 в шкірі призводить до часткової феноскопії EDA-A1, що надмірно експресує мишей епідермісом, ми припустили, що A20 може бути негативним регулятором шляху EDA. Справді, використовуючи NF-κB-залежну репортерну люциферазу (Luc), ми продемонстрували, що A20 блокує EDAR-індуковану активацію NF-κB у клітинах HEK293T у подібній мірі, як активація NF-κB B, індукована TNF (рисунок). 5а). Використовуючи делеційні мутанти, ми могли б продемонструвати, що EDAR-індукована активація NF-κB інгібується A20-вмісним C-кінцевим доменом Z20, але не N-кінцевим DUB-доменом (рис. 5b та додаткова фігура). 1), що вказує на те, що активність DUB не потрібна для інгібування активації NF-κB. Щоб перевірити це, ми також протестували двоточковий мутант (A20 D100A/C103A), який не має активності DUB 32 (рис. 5c та додатковий малюнок 1). A20 D100A/C103A був настільки ж ефективним, як дикий тип A20, у пригніченні EDF, індукованого NF-κB, підтверджуючи, що активність A20 DUB для цього ефекту не потрібна.

Стимуляція EDA-A1 індукує експресію A20 під час розвитку нальоту волосся. a ) Експресія A20 була візуалізована шляхом гібридизації in situ на зародках з дефіцитом EDA та на WT E14, темно-синюшний колір, що вказує на позитивний сигнал in situ. На правій панелі зображено вібраційний виріз із нальотом для волосся (стрілка). ( b ) Всю гібридизацію in situ проводили на ембріонах E12, використовуючи антисенсорний зонд для A20 (ліві панелі) або Wnt10b (права панель) як позитивний контроль для експресії в зубному нальоті (верхні панелі) та грудній нирці (нижні панелі) . F, передні ноги; Н, задня кінцівка; I, плакод різака; м, бруньки грудей; М, молярний код; Т, мова

Повнорозмірне зображення

обговорення

Як і IkBα, A20 є важливим негативним регулятором сигналізації та запалення NF-κB. 25 Однак способи їх дії абсолютно різні. Функція IkBa зв’язується безпосередньо з NF-κB та відокремлюється від ядра, тоді як A20 є ферментом, що редагує убиквітин, який інактивує кілька цілей у шляху NF-κB. IKBa завжди присутній у нестимульованих клітинах для обмеження неконтрольованої активації NF-kB B за відсутності специфічного запального тригера. На відміну від цього, у більшості нестимульованих клітин експресія A20 є слабкою, але сильно індукованою при активації сигналізації NF-κB. Оскільки експресія IkBa додатково індукується спрацьовуванням NF-κB, і IkBa, і A20 беруть участь у циклі негативного зворотного зв'язку при активації NF-κB. Гіперзапалення у IkBα або повних нульових мишей A20 та їх передчасна смерть вказують на критичні функції IkBa та A20 у регуляції NF-κB. 24, 35, 36, 37

Надмірне передавання сигналів NF-κB в шкіру, наприклад, у кератиноцитах, специфічних для мишей з α-нокаутом IκB та трансгенних мишей K5-IKK2, індукує дерматит. 37, 38 Несподівано, хоча у мишей A20 EKO розвинулася епідермальна гіперпроліферація, у них не виникло спонтанного запалення. Наявність функціонального IKBa може бути достатнім для контролю незначних запальних реакцій проти екологічних образ. В якості альтернативи надлишкові ферменти DUB, які контролюють активацію NF-κB, такі як CYLD, можуть бути активними в шкірі. Хоча CYLD є помітним в епідермісі, CYLD -/- миші не виявляють шкірних відхилень. 28 Абляція A20 та CYLD може знадобитися при спонтанному важкому дерматиті.

Ми показуємо, що епідермальна делеція A20 призводить до численних відхилень в ектодермальних органах, подібних до переактивації шляху EDA. 18, 19, 20, 21, 22, 39 Подібність мишей A20 EKO до мишей, що надмірно експресують EDA-A1 або EDAR, та пригнічення передачі сигналів EDAR A20 in vitro настійно свідчить про те, що гіперактивація шляху EDA є основною причиною A20. ЕКО-фенотип. Цей висновок підтверджується нашим висновком про те, що EDA-A1 індукує експресію A20 і що мРНК A20 ко-локалізується з сигнальною активністю Edar та NF-κB у розвитку фолікулів волосся. Відомо, що A20 інгібує передачу сигналів NF-κB, індуковану різними сигнальними шляхами, і було показано, що він залежить від активності DUB свого домену OTU та від лігування убиквітину C-кінцевих Zn-пальців. Ми могли б продемонструвати, що активність DUB A20 не бере участь у пригніченні передачі сигналів EDAR.

Подібність між мишами A20 EKO та трансгенними мишами EDA-A1 включає дефекти нігтів та волосся та гіперплазію сальних залоз. Додаткові зуби та соски також розроблені для трансгенних препаратів EDA-A1, але цих відхилень ніколи не спостерігалося у мишей AKO EKO. Можливо, сигналізація EDA-A1 не регулюється A20 на цих ділянках, що корелює з відсутністю виявленої експресії A20 у кодах зубного нальоту зубів та бруньок грудей. Можливо також, що для формування надмірних зубних і грудних бруньок потрібна більш сильна активність EDAR, що може бути досягнуто надмірною продукцією ліганду, але не шляхом усунення механізму негативного зворотного зв'язку, який послаблює передачу сигналів. Інше пояснення полягає в тому, що опосередкована K14-Cre делеція A20 могла статися занадто пізно, щоб дозволити індукцію позаматкових зачатків органів, оскільки експресія K14-Cre найсильніша у E15, тоді як індукція зубних та молочних кодів починається з E11 до E12. 41

На закінчення ми виявили, що A20 - це індукований EDA-A1 білок, який діє як інгібітор EDAR-залежної сигналізації NF-κB, незалежно від його активності DUB. Отже, генетична делеція A20 у кератиноцитах впливає на нормальний розвиток епідермальної мітки, подібно до того, що спостерігається у трансгенних мишей, що надмірно експресують EDA-A1 або EDAR.