предметів
реферат
Ізольований мітохондріальний комплекс IV (оксидаза цитохрому с) є важливою причиною захворювання мітохондрій у дітей та дорослих. Це генетично гетерогенно, оскільки як кодовані мтДНК, так і кодовані ядерними продуктами гени вносять свій вклад у структурні компоненти та фактори складання. Патогенні варіанти всередині цих білків пов’язані з клінічною мінливістю, від залучення ізольованих органів до прояву мультисистемних захворювань. Описано дефекти більш ніж 10 складних факторів IV комплексу, включаючи нещодавню мутацію ліванського засновника в PET100 у пацієнтів із синдромом Лі. Ми представляємо клінічне та молекулярне обстеження пацієнта із смертельним, неонатальним настанням ізольованого дефіциту комплексу IV, пов’язаного з поліорганною участю, який народився в родині пов’язаних британських азіатських сімей з першої сім’ї. Секвенування екзомоми виявило гомозиготний варіант усічення (c.142C> T, p. (Gln48 *)) у гені PET100, що призводить до повної втрати ферментної активності та складання голокомплексу. Наш звіт підтверджує мутацію PET100 як важливу причину ізольованого дефіциту комплексу IV поза ліванською популяцією, розширюючи фенотиповий спектр, пов'язаний з аномаліями цього гена.
Окисне фосфорилювання мітохондрій (OXPHOS) є основним шляхом виробництва аденозинтрифосфату (АТФ) в клітинах еукаріотів. Ця система OXPHOS містить п’ять трансмембранних комплексів (I-V), які складаються з
Тут ми повідомляємо про застосування послідовності цілої екзоми для з’ясування основи ізольованого дефіциту ЦОГ у педіатричного пацієнта з важкою та летальною неонатальною презентацією мітохондріальної хвороби через гомозиготний варіант усічення гена PET100. Попередні дослідження на дріжджах визначили ген PET100 як фактор біогенезу ЦОГ, 21, 22, 23, а пізніша мутація Лівану у засновника PET100 була описана у 10 осіб із синдромом Лі. Фібробласти та скелетні м’язи у нашого пацієнта виявляли порушення активності комплексу IV, пов’язане з глибоким розладом у складанні ЦОГ та зниженням рівнів у рівноважному стані білків комплексу IV. Ці дані надають додаткові докази того, що PET100 є важливим фактором, що бере участь у дозріванні та складанні комплексу IV.
Предмети та методи
Пацієнт 1
Наш пацієнт (ID 73387) - це дитина, яка народилася в Імперському курорті в 34-тижневій вагітності в сім'ї британського пакистанського брата першого кузена. Антенатальні обстеження показали, що вона маленька в терміні вагітності, при народженні важить 1,19 кг, окружність голови 26,7 см, значно нижче 0,4 сантиля. Індукція пологів через затримку росту сталася, але не вдалася, що призвело до екстреного кесаревого розтину. Оцінка за шкалою Апгара становила 4 за 1 хв, 7 за 5 хв та 9 за 10 хв. Вона потрапила до відділення інтенсивної терапії новонароджених для постійної вентиляції дихальних шляхів із позитивним тиском.
Молекулярна генетика
Загальну геномну ДНК отримували за допомогою стандартних методів, а область кодування плюс межі інтронів та екзонів кількох збірок COX (SURF1, SCO1, SCO2, COX10, COX14, COX15, COA5, LRPPRC, TACO1, FAM37A) та структурні (NDUFA4) гени ампліфікували з використанням специфічних для локусу праймерів (послідовності доступні за запитом), секвенування за допомогою набору BigDye v3.1 та капілярного електрофорезу на платформі флуоресцентного секвенування ABI3130xl (Life Technologies, Warrington, UK).
Секвенування всієї екзоми проводили для визначення генетичної основи представлення мітохондріальної хвороби цієї дитини, як описано вище. Набір SureSelect Human All Exon 50 Mb V5 (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США) був використаний для збагачення кодуючих фрагментів ДНК, а секвенування проводили на системі HiSeq2000 (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). BWA (версія 0.5.8) був використаний для узгодження читання з людським довідковим набором (hg19) та однонуклеотидними варіантами (SNV), а невеликі вставки та видалення були виявлені за допомогою SAMtools (версія 0.1.7). Середнє покриття було 128-кратним, а> 97% цільової області було покрито принаймні 20-кратним, що дозволяло здійснювати високонадійні дзвінки. Детальна статистика послідовності наведена в таблиці 1.
Стіл в натуральну величину
Лізис клітин та вестерн-блот
Культивовані фібробласти збирали і лізували в 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 130 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2, 1 мМ фенілметансульфонілфториду (PMSF), 1% нонідету Р-40 (об./Об.) Та 1 х вільних протеаз інгібітора ЕДТА ( Пірс, Рокфорд, Іллінойс, США). Білкові лізати (40 мкг) розділяли за розміром на 12% гелях за допомогою додецилсульфату натрію - електрофорез у поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) та електрофоретично переносили на мембрану PVDF (Immobilon-P, Millipore Corporation, Дармштадт, Німеччина). Імуноблотинг проводили з використанням первинних та кон'югованих з HRP вторинних антитіл.
Препарат мітохондрій та синій нативний електрофорез
Культурні фібробласти збирали, ресуспендували в буфері для гомогенізації (НВ) (0,6 М манітолу, 1 мМ етиленгліколь тетраоцтової кислоти, 10 мМ трис-HCl рН 7, 4,1 мМ PMSF і 0,1% (об./Об.). Бичачий сироватковий альбумін (BSA )) і піддали переходу гомогенізації 3 х 15 із використанням тефлонового скляного гомогенізатора Даунса при 4 ° С. Для видалення ядер та залишків клітин використовували стандартне диференціальне центрифугування (400 г протягом 10 хвилин), а мітохондрії остаточно гранулювали при 11 ° С. 000 г протягом 10 хвилин при 4 ° С. Мітохондрії промивали HB без BSA і кінцеву гранулу розчиняли в н-додецил-β-D-мальтозиді (DDM) (Sigma) при 2 мг/мг білка на льоду протягом 20 хвилин. Після центрифугування (100 000 г протягом 15 хвилин при 4 ° C) супернатант збирали і додавали Coomassie Blue G-250 (AMS Biotechnology (Europe) Ltd, Абінгдон, Великобританія). Білки мембрани мітохондрій (50 мкг) завантажували в NativePAGE 4-16% гель BisTris (Life Technologies), електрофоретично відокремлювали і переносили на мембрану PVDF. Потім мембрану імуноблотували антитілами проти комплексів OXPHOS.
імуноблотинг
Для іммуноблотингу використовувались наступні первинні антитіла: NDUFA9 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, A21344), NDUFB8 (Abcam, Cambridge, UK, ab110242), SDHA (MitoSciences, Eugene, OR, USA, MS204), UQCRC2 (Abcam, ab14745), COX1 (Abcam, ab14705) і COX2 (молекулярні зонди, A6404), ATP5A (Abcam, ab14748), ATPB (Abcam, ab14730) і TOM20 (Санта-Крус, Гейдельберг, Німеччина, sc11415). Використовували кон'юговані HRP проти миші або проти кролика вторинні антитіла (P0260 та P0399; Dako, Glostrup, Данія). Набір для хемілюмінесценції ECL Prime Kit (Amersham, Little Chalfont, Великобританія) та система обробки зображень ChemiDocMP (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Великобританія) використовувались для виявлення сигналів, а програмне забезпечення Image lab 4.0.1 (Bio-Rad) для аналізу.
результат
Гістохімія м’язів та аналіз дихальних ланцюгів
Аналіз м’язової біопсії пацієнта показав серйозну та глобальну втрату гістохімічної активності ЦОГ протягом усього періоду (не показаний), підтверджений спектрофотометричним тестом діяльності дихальних ланцюгів, який продемонстрував важкий та ізольований дефіцит комплексу IV в гомогенатах м’язів (рис. 1а). ). Це спостереження було підтверджене у пацієнтів з фібробластами, у яких активність комплексу IV була значно знижена (Рисунок 1b).
Виявлення дефіциту ізольованого мітохондріального дихального ланцюга комплексу IV у м’язах та фібробластах та аналіз варіанту PET100. Оцінка активності окремих ферментів дихального ланцюга в м’язах ( a ) та фібробласти ( b ) виявив важкий комплекс OXPHOS, що впливає на комплекс IV в ізоляції пацієнта (сині смуги) порівняно з контролем (червоні смуги); середня активність ферментів, показана для контролю м’язів (n = 25) та контролю фібробластів (n = 10), визначається як 100%. ( c ) Сімейний родовід, який підтверджує стан перевізника с. (Gln48 *) у клінічно не уражених батьків, тоді як пробанд гомозиготний за варіантом усічення.
Повнорозмірне зображення
Молекулярно-генетичні дослідження виявляють новий усічений варіант PET100
Мутація PET100 призводить до пошкодження комплексу IV
Подальша характеристика характеру біохімічного дефекту, асоційованого з варіантом PET100, проводилася у фібробластів пацієнта. Рівноважні рівні окремих субодиниць комплексу OXPHOS та подальше збирання в мітохондріальні комплекси дихальних ланцюгів аналізували за допомогою синьо-нативного PAGE (BN-PAGE) та SDS-PAGE.
Аналіз рівноважних рівнів компонентів комплексу OXPHOS підтвердив значне зниження рівня COXI та COXII у пацієнтів порівняно з контрольними фібробластами (рис. 2а). Не було знайдено жодних суттєвих змін у будь-якому рівні стійкого стану всіх інших аналізованих комплексів (I, II, III та V), хоча рівні комплексу III зростали відповідно до ферменту дихального ланцюга.
1,6-кратний на основі денситометричного аналізу (рис. 2а). Подібне спостереження було зроблено раніше у пацієнтів з патогенними варіантами іншого гена набору COX, SURF1. 28 TOM20 був використаний як вступний маркер мітохондрій і підтвердив однакове навантаження контрольних білків мітохондрій та пацієнтів.
Рівноважні рівні компонентів та комплексів OXPHOS. ( a ) Клітинний лізат контрольних (C1 і C2) та пацієнтів (P) фібробластів (40 мкг) аналізували за допомогою SDS-PAGE (12%) та імуноблотингом. Специфічні для субодиниць антитіла використовували проти CI (NDUFA9, NDUFB8), CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1, COX2) та CV (ATPB). Зовнішній маркер мембрани мітохондрій, TOM20, використовували як контроль навантаження. ( b ) Мітохондріальні білки (50 мкг), виділені у пацієнтів (P) та контрольні (C1) фібробласти, аналізували за допомогою одновимірної BN-PAGE (градієнт від 4 до 16%), використовуючи специфічні для субодиниць антитіла, як зазначено (CI (NDUFA9)). CII (SDHA), CIII (UQCRC2), CIV (COX1) та CV (ATP5A)) для оцінки складання окремих комплексів OXPHOS. Комплекс II (SDHA) використовували як контроль навантаження.
Повнорозмірне зображення
Відповідно до цього зниження рівня рівномірного білка CIV та біохімічних вимірювань активності комплексу дихальних ланцюгів (рис. 1b), аналіз BN-PAGE виявив значно зменшену кількість комплексу комплексу IV у клітинах пацієнтів порівняно з контролем за віком (рис. 2b). Ця втрата комплексу OXPHOS була специфічною, оскільки профіль складання комплексів I, II, III та V був нормальним.
Ці дані вказують на те, що гомозиготний варіант p100 (Gln48 *) PET100 призводить до специфічної та серйозної втрати субодиниць COX та повністю зібраного внутрішньовенного комплексу.
обговорення
Хоча ізольований дефіцит ЦОГ вважався одним із найпоширеніших порушень енергетичного обміну, він має різноманітну генетичну етіологію, що відображає складний характер біогенезу та складання компонентів мтДНК та ядерних кодованих компонентів у зрілий голофермент; процес, якому сприяє багато шаперонових білків. Патогенні варіанти були описані в ряді факторів складання, необхідних для утворення функціонального ферменту ЦОГ. 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Нещодавно у 10 ліванських осіб з ізольованим дефіцитом ЦОГ, які страждають синдромом Лі та судомами, була виявлена основна мутація високозбереженого фактора складання ЦОГ PET100. 24
Тут ми повідомляємо, що новий варіант усіченого PET100 викликає летальний інфантильний молочнокислий ацидоз та ізольований дефіцит ЦОГ у дитини, яка народилася від рідного британського пакистанського батька. Варіант патогенної нісенітниці (c.142C> T, p. (Gln48 *)) у гені PET100 був ідентифікований шляхом секвенування всієї екзоми, що призвело до порушення активності ферментного комплексу IV та ненормальної збірки ЦОГ. Наші результати узгоджуються з раніше опублікованими даними, які свідчать про те, що PET100 є консервативним фактором біогенезу, який бере участь у дозріванні комплексу IV у людей 24 та дріжджів. 21, 22, 23 Дріжджовий гомолог PET100 не є важливим для локалізації поліпептидів ЦОГ у внутрішній мітохондріальній мембрані 21, але відіграє важливу роль у подальших процесах складання, де він полегшує збирання проміжних продуктів ЦОГ. На відміну від цього, виявляється, що PET100 людини потрібен раніше в процесі складання мітохондріально кодованих субодиниць COX. Наші результати демонструють важливість PET100 у функції OXPHOS та підтримують попередні дослідження; 21, 22, 23, 24, однак, вимагає подальших досліджень, щоб повністю зрозуміти точну роль цього ферменту у дозріванні голоферменту ЦОГ.
Секвенування цілої екзоми - це швидкий та ефективний підхід для з’ясування молекулярних основ порушень дихального ланцюга мітохондрій, включаючи ізольований дефіцит ЦОГ. Наші висновки підтверджують, що PET100 є важливим геном захворювання-кандидата у пацієнтів з ізольованим дефіцитом ЦОГ. Недавні досягнення у послідовності наступного покоління дозволили швидко та точно діагностувати пацієнтів із простими мітохондріальними захворюваннями у невеликих сім'ях, полегшуючи відповідні консультації та забезпечуючи такі профілактичні стратегії, як пренатальна діагностика та генетичне профілювання до імплантації.