предметів

реферат

Тиреоїдит Хашимото (ХТ), який характеризується виробленням аутоантитіл проти щитовидної залози, є локалізованим аутоімунним захворюванням. Встановлено, що ХТ має 55% згоди у монозиготних близнюків. 1 Репплінгер та ін. 2 говориться про високу поширеність підвищеної захворюваності на ГТ серед жінок, яка в сім разів вища, ніж у чоловіків. У патогенезі цього захворювання беруть участь різні генетичні та екологічні фактори. 3 Добре відомо, що хронічне запалення, яке виникає під час ГТ, спричиняє значне підвищення рівня цитокінів та інших медіаторів запалення, що в кінцевому підсумку призводить до руйнування щитовидної залози. 4 Більш конкретно, взаємодія декількох генів та факторів навколишнього середовища може підвищити чутливість до НТ та тяжкість захворювання. 5

Полі (ADP-рибоза) полімераза-1 (PARP-1) вважається одним із генів-кандидатів, відповідальних за патогенез запальних ситуацій. Вважається, що PARP-1 відіграє важливу роль у започаткуванні шляху відновлення ДНК, хоча високі рівні його активації також пов'язані зі збільшенням апоптозу. Нещодавно було показано, що розвиток і прогресування запальних захворювань порушено на моделях тварин, що нокаутують PARP-1, що використовують інгібітори PARP-1. 6, 7 Результати кількох досліджень показали, що інактивація PARP-1 захищає від ендотоксичного шоку, коліту, пневмонії та інших захворювань, таких як черепно-мозкова травма, ішемія головного мозку та міокарда, інсульт, ревматоїдний артрит та серце, пов'язані із цукровим діабетом. хвороби. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Хоча точна роль PARP-1 у запальному каскаді ще не відома, всі наявні дослідження щодо PARP-1 свідчать про те, що цей ген є сильним кандидатом і генетичним фактором для розробки HT.

Показано, що ген PARP-1 (OMIM 173870), розташований у хромосомі (1q41-43), містить алельні поліморфізми, пов'язані зі сприйнятливістю до різних захворювань, деякі з яких є запальними. Крім того, в промоторній області генів PARP-1 виявлено багато сайтів зв'язування фактора транскрипції; тому генетичні варіанти в цій області можуть впливати на експресію PARP-1. 17 Кілька варіантів (C410T (rs2793378), Poly (A) n, C1362T та G1672A (rs7527192)) були виявлені в промоторній області, і є кілька досліджень, які вивчали взаємозв'язок між цими промоторними поліморфізмами та патогенезом багатьох захворювань. сайт T2444C (rs1136410) (також відомий як Val762Ala), який спричиняє зміну T на C, Val на Ala в екзоні 17, був визначений Cottet et al. 18 За словами Ванга та його колег, поліморфізм T2444C знижує ферментативну активність PARP-1 на

У цьому дослідженні ми запитали, чи можуть два промоторні поліморфізми (rs2793378 та rs7527192) та активний поліморфізм (rs1136410) у гені PARP-1 схиляти людей до хвороби HT у турецькій жіночій популяції.

Пацієнти та методи

Вивчення предметів

У це дослідження були включені сто сорок одна жінка, якій діагностовано ГТ в амбулаторії ендокринних та метаболічних захворювань Медичного університету Черрахпаша в Стамбулі. Контрольну групу складали сто п'ятдесят здорових жінок подібного середнього віку. Критеріями виключення для участі у дослідженні були вагітність, куріння, використання ліків, що відпускаються за рецептом, та наявність аутоімунного захворювання, яке може вплинути на результати дослідження.

Хоча турки етнічно різноманітні, європейська сторона Стамбула ретельно відбирала всі випадки та засоби контролю, щоб гарантувати, що всі особи мають турецьке походження. Усі учасники дослідження не мали стосунків та надавали підписану інформовану згоду перед відбором зразків та збору даних. Протокол дослідження був затверджений Комітетом інституційної етики Медичної школи Черрахпаша Стамбульського університету.

Генотипування поліморфізмів PARP-1

Геномну ДНК у досліджуваних досліджували методом осадження етанолом. Концентрацію та чистоту ДНК вимірюють на спектрометрах NanoDrop (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) та визначають, використовуючи оптичну щільність 260/280 нм. Генотипи PARP-1 C410T та G1672A визначали, використовуючи метод поліморфізму довжини фрагмента рестрикції (RFLP). Праймерами, використовуваними для ампліфікації поліморфних ділянок, були F: 5'-TCCAGTGGCACTATCAT-3 'та R: 5-GTTGTGAGACATAGGCCGAATC-3' для rs2793378 та F: 5'-GCGAGACCCTGTCCCTAA-3 'та R: 5-TCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 16

Продукти ампліфікації давали фрагмент пари 298 базових (bp) для rs2793378 та фрагмент 187 bp для rs7527192. Десять мікролітрів продукту ампліфікації rs2793378 розщеплювали однією одиницею Hpy31 (Dde I) (New England Biolabs, Беверлі, Массачусетс, США), інкубували протягом 12 годин при 37 ° C та електрофорезували протягом 30 хвилин при 120 В. на 3% агарозі гель. Гомозиготність загального алелю (представленого генотипом СС) була позначена смугами 145 і 109 п.н., тоді як гомозиготність варіанта алелю (представленого генотипом ТТ) представлена ​​смугами 127 і 109 п.н. Десять мікролітрів продукту ампліфікації rs7527192 розщеплювали однією одиницею Bsh1236I (BstUI) (MBI, Fermentas, Вільнюс, Литва), інкубували протягом 12 годин при 37 ° C і розділяли на 3% агарозному гелі. Гомозиготність загального алелю (представленого генотипом GG) позначалася смугами 152 та 35 п.н., тоді як гомозиготність варіанта алеля (представленого генотипом АА) була представлена ​​єдиною смугою 187 п.н., оскільки цей поліморфізм руйнує сайт обмеження для Bsh1236I. 20

Для rs1136410 умови ПЛР встановлювали при 95 ° С протягом 4 хвилин для денатурації, після чого проводили 35 циклів по 94 ° С протягом 30 с, 62 ° С протягом 45 с і 72 ° С протягом 45 с для етапу відпалу, після чого остаточне продовження при 72 ° С протягом 10 хвилин. Використовуються такі праймери: прямий праймер 5'-TGAGGAAGGCCTGACCCTGT-3 'і зворотний праймер 5'-TGACCAGCAGGAGGGTTTGC-3'. Зміни послідовності для rs1136410 визначали за допомогою двонаправленого секвенування. Послідовності ампліконів оцінювали за допомогою робочого середовища CLC 3.6.1 (Данія).

Аналіз гаплотипів

Гаплотипи були сформовані на основі генотипових даних. Аналіз дисбалансу зв'язування (LD) та гаплотипів проводили за допомогою Haploview 4.2, який використовує алгоритм максимізації очікувань (EM).

Обробка та аналіз даних

результат

Навчання населення

У цьому дослідженні брали участь 141 пацієнт із тиреоїдитом Хашимото у віці від 39 до 55 років (у середньому 48,9 року) та 150 осіб у віці від 37 до 54 років (у середньому 46,6 року). Не було суттєвої різниці між віком випадків та контролем.

Встановлено, що середні рівні тиреотропного гормону (ТТГ), антиТРО та антиТГ антитіла у хворих на ГТ становили 8,3 ± 6, 8 мкМЕ/мл, 806, 7 ± 447, 3 МО/мл та 382, ​​7 ± 207,4 МО/мл. Рівні антитіл до ТТГ, AntiTg та AntiTPO у контрольних суб'єктів становили 2,8 ± 1, 2 МО/мл, 65,4 ± 59,7 МО/мл та 27 ± 15,8 МО/мл. Рівні антитіл до ТТГ, AntiTPO та AntiTG у хворих на ГТ були статистично вищими, ніж у контрольній групі, ніж очікувалося (P = 0, 0305, 0, 0296, 0, 0242).

141 пацієнт з НТ та 150 контрольних суб'єктів були протестовані на наявність rs2793378, rs7527192 та rs1136410. Не було статистично значущих відмінностей між пацієнтами та контролем щодо їх середнього віку (41, 1 ± 11, 7 років, Р = 0,352), статі (усі жінки, Р = 0,881) та етнічного походження (турецька), що вказує що частота, відповідна між групами.

Поширення PARP-1 SNP в HT

Розподіл генотипів rs2793378, rs7527192 та rs1136410 у контрольній групі був у HWE. Розподіл генотипу та частота алелів усіх досліджених поліморфізмів наведені в таблиці 1.

Стіл в натуральну величину

Ми виявили значну зв'язок між PARP-1 rs1136410 та rs7527192 та HT. Частота гетерозиготного генотипу ТС rs1136410 була значно вищою у контролі порівняно з пацієнтами (АБО: 2, 504, 95% ДІ: 1, 48–4, 23, Р = 0,001). Крім того, встановлено, що частота алелю C rs1136410 була статистично вищою у здоровій групі (АБО: 1632, 95% ДІ: 1, 1-2, 403, Р = 0,013), а rs1136410 зберігав свою значимість після корекції Бонферроні. Частота гетерозиготного генотипу GA rs7527192 була значно вищою у контролів (АБО: 1, 633, 95% ДІ: 1, 017-2, 623, Р = 0,042), ніж у пацієнтів. Крім того, встановлено, що частота алелю A rs7527192 була статистично вищою у здоровій групі (АБО: 1,492, 95% ДІ: 1, 039-2, 122, Р = 0,03); хоча ні генотип GA, ні алель A з rs7527192 не зберегли значення після корекції Бонферроні. Крім того, C-алель rs1136410 не виявляв значущості після корекції Бонферроні, а PARP-1 rs2793378 не виявляв захисного або небезпечного ефекту при хворобі HT. Усі результати наведені в таблиці 1.

Аналіз гаплотипу PARP-1 SNP

Ми також дослідили, чи перебувають ці три поліморфізми в рівновазі, що зв'язує, та чи є загальні гаплотипи, пов'язані із захворюваннями та рідкісними гаплотипами (з частотою 5%).

Поширеність гаплотипу CGC була значно вищою у контролів (співвідношення випадків до контролів: 0,061: 0, 146, P = 0, 0252, x 2 = 5,01), як показано в таблиці 2. Перший маркер гаплотипу CGC, C - Алель дикого типу для RS2793378. Другий маркер гаплотипу CGC, алель G, є диким типом для rs7527192. Третій маркер, алель С, мутант для rs1136410. Різниця базувалася на третьому маркері, алелі C rs1136410, який служить захисним фактором. Однак, оскільки це дослідження базувалося на невеликому обсязі вибірки, ми використовували корекцію Бонферроні, щоб зменшити помилку типу I. Після корекції Бонферроні аналіз гаплотипів не показав значущості. Крім того, два SNP у PARP-1 (rs1136410 та rs7527192) мали сильну LD (Рисунок 1).

snps

Невідповідність пар нерівноважної діаграми для досліджених ОНП PARP-1. Більше значення r 2 означає більш темний колір. Позиція сайту хромосоми PARP-1 rs2793378 дорівнює 226597341, сайту rs7527192 дорівнює 226596079 і сайту rs1136410 дорівнює 226555302.

Повнорозмірне зображення

Комбінований аналіз генотипів PARP-1 SNP

Таблиці 3, 4, 5 узагальнюють дослідження асоціації між комбінованими генотипами трьох ОНП та загальним ризиком для НТ. SNP PARP-1 rs2793378 та rs7527192 показали статистичну значимість між комбінованими генотипами у хворих на ГТ та контрольних груп. Комбіновані частоти генотипів CC/GA, CT/GG та TT/GA були значно вищими в контрольній групі порівняно з групою HT у порівнянні з комбінованим генотипом CC/GG (OR: 2, 956, 95% ДІ: 1, 114–7, 840, P = 0,027, АБО: 2,66, 95% ДІ: 1, 13 - 6, 259, P = 0,023, АБО: 4, 644, 95% ДІ: 1, 455 - 14, 822, P = 0, 007 відповідно). Після корекції Bonferroni лише комбінований генотип TT/GA залишався значущим і виявився значущим захисним фактором проти хвороби HT (P = 0,007), як показано в таблиці 3.

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Окрім вищезазначених результатів, інших суттєвих відмінностей між множинними порівняннями rs7527192-rs1136410 та rs2793378-rs1136410 у пацієнтів із ГТ та контрольних груп не було (таблиці 4 та 5).

обговорення

Виходячи з досліджень асоціації щитовидної залози (GWAS), стає ясно, що генетичні фактори є важливим фактором функції щитовидної залози та аутоімунітету. Нещодавно було встановлено, що інтронічний варіант VAV3 (фактор обміну гуанінових нуклеотидів vav3, rs12126655) пов'язаний з концентрацією ТТГ, а інший варіант (rs2071403), розташований на 75 п.н., проксимально від вихідного місця трансляції ТРО, був суттєво пов'язаний з антитілами до плазми . Інший інтронічний варіант HLA-DPB2 (rs733208) також був пов'язаний із позитивністю антитіл до TPO. 21 Ерікссон та ін. 22 продемонстрували зв'язок між гіпотиреозом та аутоімунною хворобою щитовидної залози з SNP у регіонах HLA класу I та II (rs2517532 та rs2516049, відповідно) та поблизу CAPZB (закриваючий білок (актинове волокно) м'язів Z-лінії, бета, rs1209EB47 Gs) фосфодіестераза 8B, rs4704397) та CTLA-4 (токсичний Т-клітинний антиген-4, rs231779). На основі досліджень генів-кандидатів, CTLA-4, як відомо, широко асоціюється з багатьма іншими аутоімунними захворюваннями, включаючи аутоімунний гіпотиреоз.

Крім того, такі варіанти, як FOXE1, фактор транскрипції щитовидної залози, були визначені як генетичні фактори ризику первинного гіпотиреозу. У GWAS від FoxE1 було запропоновано FoxE1 та PARP-1 брати участь у репресорному комплексі NIS людини, який є трансактивним транскрипційним репресором, знайденим у клітинах карциноми щитовидної залози, який містить PARP-1 та функціонує завдяки своїй полі (ADP-рибозильна активність). . Отже, PARP-1 є потужним та придатним ген-кандидатом для ідентифікації асоціацій між генетичними факторами при аутоімунітеті щитовидної залози.

Кілька досліджень рішуче підтверджують той факт, що PARP-1 відіграє важливу роль в аутоімунних запальних захворюваннях. Інгібітори PARP-1 або делеції PARP-1 використовуються у багатьох терапевтичних підходах, які засновані на блокаді тканин або системному запаленні. 28, 29 Нещодавно були запропоновані альтернативні шляхи, що включають здатність PARP-1 регулювати транскрипцію генів, пов'язаних із запаленням. Кілька останніх публікацій вказують на те, що ядерний білок PARP-1 регулює транскрипцію та синтез медіаторів запалення. Крім того, взаємозв'язок між активністю PARP-1 та запаленням було широко досліджено, і зв'язок із запаленням був твердо встановлений завдяки фармакологічному пригніченню активності PARP-1, що покращило запальну реакцію. 6, 30 Пригнічення активності PARP-1 є захисним при широкому діапазоні запальних станів, таких як серцево-судинні захворювання, діабет, ревматоїдний артрит та інсульт. 13, 31 Отже, ген PARP-1 може бути вагомим кандидатом на основі спостережень, проведених у нокаутованих мишей, та забезпечує перспективні терапевтичні підходи до запальних захворювань з використанням інгібіторів PARP-1. .

Як варіант, концентрація білка PARP-1 контролюється безпосереднім регулюванням активності промотору. Отже, поліморфізми в промоторній області можуть також впливати на активність PARP-1. У промоторній області було виявлено кілька сайтів транскрипції, а також 3 набори коробок CCAAT/TATA, які забезпечують сайт зв'язування для факторів транскрипції YY1. Крім того, у цій області виявлено чотири варіації послідовності: rs2793378, Pol (A) n, C1362T та rs7527192. 16, 20 За даними Infante та співавт., 32 поліморфізм C410T, що знаходиться в гетерозиготному стані, збільшив ризик хвороби Паркінсона, тоді як гетерозиготність rs7527192 суттєво затримувала початок захворювання. У цьому дослідженні ми не знайшли жодного значення щодо rs2793378.

Нещодавно rs2793378, rs7527192 та rs1136410 були вивчені при багатьох запальних аутоімунних захворюваннях, включаючи RA, 16 AR, 33 астму, 34 нефрит та артрит у пацієнтів із СЧВ 35 та хворобою Альцгеймера, 36, 37, як описано вище. У нашому дослідженні було встановлено, що гетерозиготний генотип GA PARP-1 rs7527192 має захисну дію на хворобу HT у турецькій популяції. Це можна порівняти з результатами Infante та співавт., Які показали, що певні варіації промоторів (rs2793378 та rs7527192) пов'язані із захистом від хвороби Паркінсона. Ми також раніше виявили, що гетерозиготний генотип rs7527192 був суттєво пов'язаний зі сприйнятливістю до алергічного риніту (AR) у турецької популяції. Крім того, у цьому дослідженні, згідно з численними порівняннями комбінованих генотипів rs2793378 - rs7527192, частота комбінованого генотипу TT/GA була значно вищою в контролі порівняно з групою HT порівняно з комбінованим генотипом CC/GG. Після корекції Бонферроні лише генотип TT/GA продовжував виявляти значення як захисний фактор. При поєднанні мутантної форми rs2793378 та гетерозиготної форми rs7527192 у пацієнтів із ГТ спостерігався значний захисний ефект.

Також було показано, що гаплотипи промотору PARP-1 пов’язані зі схильністю до деяких хронічних запальних захворювань, таких як AR, RA та целіакія. Також виявлено захисний ефект гаплотипу поліморфізму гена PARP-1 на хворобу Альцгеймера. 37 гаплотипів rs2793378, rs7527192 та rs1136410 не асоціювались із підвищеним ризиком розвитку АР. 33 За словами Паскуала та співавт. 16 гаплотипів PARP-1 (-410, -1327, мікросупутниковий повтор Каліфорнії) відіграють роль у сприйнятливості до RA в іспанській популяції, тоді як варіант rs7527192, схоже, не є частиною цього гаплотипу. Хоча було встановлено, що гаплотип CGC має захисний ефект на основі алелю C (Ala) rs1136410, він не витримав корекції Бонферроні.

rs1136410 присутній приблизно у 5-33% загальної кількості населення. 19 Ми раніше повідомляли, що алель T (Val) rs1136410 пов'язаний із підвищеним ризиком розвитку астми. Крім того, rs1136410 суттєво асоціюється з ішемічною хворобою серця, яка також є запальним процесом. 39 Hur та співавт. 35 продемонстрували, що несинонімічний варіант + 40329T → C (V762A) також суттєво асоціюється з підвищеним ризиком артриту у корейських пацієнтів із СЧВ. Однак, за словами Onaran та співавт., 40 rs1136410 не асоціювались із ризиком розвитку ревматоїдного артриту. Також виявлено, що варіанти Val762 PARP-1 rs1136410 збільшують ризик діабетичної полінейропатії у пацієнтів з діабетом 1 типу. Крім того, ми виявили, що гетерозиготний генотип TC (Val/Ala) rs1136410 мав захисний ефект на чутливість до НТ у турецькій популяції навіть після корекції Бонферроні.

Вважається, що PARP-1 та ядерний фактор каппа B (NF-κB) відіграють важливу роль у запальних захворюваннях. Було показано, що PARP-1 може діяти як коактиватор NF-κB з точки зору запальних процесів у клітині. Ці висновки дали нам нові уявлення про патогенез різних запальних захворювань, таких як ХТ. Раніше ми повідомляли, що частота алелю делеції NF-κB rs28362491, який супроводжує високий рівень інтерлейкіну-6 (IL-6), була значною у групі хворих на НТ. 43 Це дослідження спирається на наші попередні дослідження.

Крім того, слід мати на увазі, що малий обсяг вибірки, який міг вплинути на статистичну потужність наших аналізів, може вважатися обмеженням цього дослідження. Незважаючи на те, що дослідження з низькою статистичною потужністю зменшує шанси виявити реальний ефект, дослідження з використанням випадків з невеликими розмірами вибірки все ще широко використовуються і можуть бути використані для оцінки раніше визначених областей-кандидатів у вибірці та більш точного визначення цілей відбору., більші зразки або дослідження реплікації забезпечують впевненість у подальших дослідженнях.

PARP-1 необхідний для активації декількох факторів транскрипції через запалення декількох медіаторів. Було припущено, що інший механізм зв'язування та активації PARP-1 внаслідок гетерозиготного генотипу rs1136410 може впливати на експресію генів, що беруть участь у запальній реакції, можливо, через змінений запальний шлях. Отже, цей поліморфізм може забезпечити захисний ефект проти HT. Однак ця гіпотеза все ще вимагає подальшого дослідження.

Підводячи підсумок, можливо, що взаємодії варіантів гена PARP-1 відіграють ключову роль в організації різних змін, які відбуваються під час запальної реакції при хворобі HT. Однак для підтвердження передбачуваної захисної ролі цих варіантів гена PARP-1 необхідні дослідження реплікації або інші функціональні дослідження з більшими розмірами зразків. Більш конкретно, великі дослідження та дослідження реплікації із залученням різних етнічних груп настійно рекомендуються для правильного визначення взаємозв'язку між поліморфізмами PARP-1 (особливо rs1136410 TC) та розвитком НТ, а також прогнозом захворювання.