реферат
Адипоцити людини можна отримати in vitro шляхом диференціації людських преадипоцитів або мезенхімальних стовбурових клітин (hMSC). Хоча функціонально подібні до свіжоізольованих клітин, детального порівняння різних типів клітин не проводилось. Антиліполітичний α 2A-адренорецептор (AR) та фермент, що руйнує цАМФ, фосфодіестераза-3B (PDE3B) беруть участь у точному налаштуванні ліполізу, але мало відомо про їх роль в людських адипоцитах або про те, чи відрізняється їх експресія та/або функція ... в жирових клітинах від різних попередників.
методологія:
Ефекти інгібування α2A-AR та PDE3B у зрілих адипоцитах були визначені та порівняні з ефектами у диференційованих преадипоцитах та жирових клітинах, отриманих hMSC. Експресія гена визначалася за допомогою ПЛР у реальному часі, а експресія білка - вестерн-блот.
результати:
Норадреналін (NA) стимулював ліполіз у преадипоцитах та зрілих адипоцитах, але значно зменшував ліполіз у диференційованих адипоцитах, отриманих з hMSC. Це було зумовлено сильною стимуляцією α2A -AR після спільної інкубації з NA та інгібітором та -2-AR-йохімбіном, відновлений NA-індукований ліполіз. Порядок реакції Йохімбіну становив hMSC> преадипоцити> зрілі адипоцити. Хоча експресія мРНК α2-AR була найвищою у зрілих адипоцитах, не було різниці в рівні білка α2A -AR між типами клітин. На відміну від цього, експресія мРНК і білка G α2 була значно вищою в адипоцитах, отриманих від MSC, що свідчить про те, що відмінності у відповіді на інгібування α2A-AR лежать на рівні після рецептора. Інкубація з аналогом цАМФ 8-бромо (8b) цАМФ посилювала ліполіз в адипоцитах, отриманих hMSC, тоді як спільна інкубація з PDE3-специфічним інгібітором OPC3911 не змінювала ліполітичний ефект. На противагу цьому, OPC3911 суттєво збільшив індукований 8bcAMP ліполіз у преадипоцитах та зрілих адипоцитах. Відповідь на інгібування PDE3B була; зрілі адипоцити> преадипоцити> знаходження hMSC, яке суттєво корелювало з експресією мРНК PDE3B, а також ферментативною активністю.
висновок:
Хоча диференційовані адипоцити різного походження демонструють подібні функціональні характеристики, існують значні відмінності в регуляції ліполізу з помітним α 2A-AR та менш вираженим ефектом PDE3B в адипоцитах MSC.
Регулювання рівня цАМФ також досягається на іншому рівні фосфодіестеразами (ФДЕ), групою ферментів, які розкладають цАМФ при активації антиліполітичними гормонами, такими як інсулін. Основним підтипом PDE в жировій тканині людини є фосфодіестераза-3B (PDE3B). Стимуляція інсуліном в адипоцитах призводить до автофосфорилювання рецептора інсуліну та зв’язування білків-адаптерів, включаючи субстрат рецептора інсуліну-1 (IRS-1). Білки-адаптери набувають декількох ефекторів, включаючи фосфатидилінозитолтрифосфаткіназу (PI3-K). Фосфатидилтрифосфатний ліпід, утворений фосфорилюванням PI3-K, виконує функцію якірної молекули та рекрутує кіназу PDK1/2 у плазматичну мембрану. PDK1/2 фосфорилює протеїнкіназу B (PKB), фермент, відповідальний за фосфорилювання та активацію PDE3. Цей сигнальний каскад призводить до зниження концентрації цАМФ, що призводить до зниження активності РКА та дефосфорилювання HSL. В людських адипоцитах індукований інсуліном антиліполіз повністю нейтралізується селективним інгібітором PDE3 OPC3911. У поєднанні з іншими дослідженнями6 це свідчить про те, що активація PDE3 є основним механізмом антиліполітичного ефекту інсуліну in vivo.
Матеріали і методи
Культура клітин адипоцитів
У зрілих культурах адипоцитів та преадипоцитів жир отримували від 13 жінок, які перенесли косметичну мастектомію або операцію на черевній порожнині. Вони були у віці від 28 до 62 років з індексом маси тіла (ІМТ) від 24 до 51 кг/м 2. Зразки жирової тканини були отримані з хірургічних відділень лікарні Хаддінге та лікарні Дандерида. Проби відбирали з підшкірного та пацієнтського депо пацієнта. Комітет з питань етики лікарні схвалив дослідження. Інформована згода була отримана від кожного суб’єкта. Зрілі адипоцити були виділені за Родбеллом. 13 Після виділення клітини промивали фосфатним буфером Кребса-Рінгера (KRP) pH 7, 4: 0,9% NaCl, 0,1 M NaH 2 PO 4, 0,154 M KCl, 0,1 M CaCl 2, 0,154 M MgSO 4, що містить 0,1% бичини сироватковий альбумін (BSA) pH 7,1, 4. Потім адипоцити розбавляли у KRP, що містить 2% BSA (акцептор FFA), глюкозу (паливо, 1 мг/мл) та аскорбінову кислоту (антиоксидант, 0,1 мг/мл).
Культури людських преадипоцитів встановлювали та диференціювали, як описано вище, 14 у 6-, 12- або 24-лункових планшетах в інкубаторі 37 ° C з 5% CO 2. Ліполіз оцінювали на 16 день диференціації.
Культура магістратури людини
Оцінка диференціації
Диференціацію преадипоцитів та hMSC оцінювали шляхом визначення активності гліцерол-3-фосфатдегідрогенази (GPDH) та фарбування специфічним для тригліцеридів червоним червоним барвником O, як описано вище. 10
Виділення РНК та ПЛР у режимі реального часу
ліполіз
Вестерн-блот
Аналіз активності PDE3B
Аналіз PDE базується на наступній реакції: цАМФ в АМФ (каталізується ФДЕ), а потім перетворення АМФ в аденозин через 5'-нуклеотидазу. Диференційовані преадипоцити та hMSC, а також зрілі адипоцити гомогенізували в буфері, що містив 50 мМ TES, 250 мМ сахарози, 1 мМ EDTA, 0,1 мМ EGTA (рН 7,5) та Complete (Roche Diagnostics, Швейцарія). Клітинні гомогенати інкубували при 30 ° C протягом 20 хвилин у загальному обсязі 300 мкл, що містив 50 мМ HEPES (рН 7,4), 0,1 мМ EGTA та 0,5 мкМ [3 H] cAMP. Змійну отруту (Crotalus atrox, Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США), що містить 5'-нуклеотидазну активність, додавали у концентрації 0,4 мг/мл, а гомогенати клітин інкубували при 37 ° С протягом 20 хвилин. Активність PDE3 визначали як кількість гідролізованого цАМФ і виражали на мг загального білка. Концентрацію білка в гомогенатах клітин визначали за допомогою аналізу білка RC/DC (Biorad, Hercules, CA, USA).
Статистичний аналіз
Значення повідомляються як середнє значення ± стандартне відхилення (sd) для даних аналізу мРНК та PDE та як середнє значення ± стандартна помилка (se) для ліполізу. Їх порівнювали зі студентським непарним t-тестом або непараметричним тестом Крускала-Уолліса, як зазначають стандартні програмні пакети.
Наркотики та хімікати
Фракцію V BSA (номер партії A-9418), 8-бромоАМФ, глюкозу, гліцерол-кіназу, NA, масло червоного O та йохімбін отримували від Sigma Chemical (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США). OPC 3911 був отриманий від Otsuka Pharmaceuticals, Японія. Усі використовувані хімічні речовини були найвищої ступеня чистоти, комерційно доступні.
результат
Адипоцити, отримані hMSC, демонструють помітний ефект α2A-AR, але не ефект PDE3B
Ліполіз в адипоцитах, отриманих hMSC. Клітини стимулювали або NA (NA), або з блокатором α2A -AR йохімбіну (NA + Yoh), або аналогом цАМФ 8pcAMP, чутливим до фосфодіестерази 3 (PDE3), з або без PDE3-специфічного інгібітора OPC3911 (8bcAMP + OPC). Вивільнення гліцерину вимірювали в середовищі через 3 години інкубації та виражали відносно активності GPDH та концентрації білка. Базальний ліполіз доводили до 100% для кожного експерименту, який повторювали принаймні чотири рази з клітинами різних донорів. Завдяки сильному антиліполітичному ефекту α2A -AR, NA зменшує ліполіз порівняно з контрольними клітинами. У присутності йохімбіну стимульований NA-ліполіз відновлювався більше ніж тричі на базальному рівні. На відміну від цього, додавання OPC до 8bcAMP не мало суттєвого впливу на швидкість ліполітики (***, статистично значуще порівняно з базальним Р ліполізом
Ліполіз у диференційованих преадипоцитах. Зверніть увагу, що індукований NA-ліполіз посилюється у присутності йохімбіну. Подібним чином ефект 8bcAMP був значно посилений у присутності OPC3911 (***, статистично значущого порівняно з базальним Р-ліполізом
Ліполіз у свіжовиділених зрілих адипоцитах. Клітини стимулювали тими ж препаратами, що і на малюнку 1. Виділення гліцерину вимірювали в середовищі через 2 години інкубації та виражали відносно вмісту ліпідів у грамах. Зверніть увагу на дещо менш виражений ефект інгібування α2A -AR та помітний ефект інгібування PDE3B (* P *** P преадипоцити> зрілі адипоцити), тоді як зворотна активність (зрілі адипоцити> преадипоцити)> HMSC-адипоцити спостерігається при активності PDE3B).
Порівняння інгібуючих ефектів у різних типах клітин. Антиліполітичний ефект α2A -AR виражався як відсоток збільшення ліполізу в клітинах, оброблених NA + йохімбіном, порівняно з клітинами, інкубованими лише в NA. Антиліполітичний ефект PDE3 виражався як відсоток збільшення ліполізу клітин, оброблених 8bcAMP + OPC, порівняно з 8bcAMP. Антиліполітичний ефект α2-адренорецепторів був значно нижчим у зрілих адипоцитах порівняно з диференційованими hMSC (Р = 0,002, t-тест Стьюдента). ). На противагу цьому, антиліполітичний ефект PDE3 був значно підвищений у зрілих адипоцитах порівняно з диференційованими hMSC (P = 0,036, t-тест Стьюдента).
Повнорозмірне зображення
Експресія α2A -AR та мРНК та білка Galfa
Експресія месенджера та білків в адипоцитах різного походження. Експресію мРНК α2A -AR (a) та Gai2 (b) оцінювали в ізольованих адипоцитах, преадипоцитах та hMSC. Експресія генів була стандартизована до 18S рРНК. Значення відображаються як середнє значення ± sd (* = P
На відміну від зменшеного ефекту пригнічення α2A -AR у зрілих адипоцитах, ефект PDE3, здається, посилюється. Це, швидше за все, пов’язано з підвищеною експресією мРНК PDE3B, що призводить до збільшення активності. Причина цього незрозуміла. PDE3 є головним ефектором антиліполітичного ефекту інсуліну. Тому посилена активність PDE3 може відображати більш високий рівень ліполітичної регуляції у зрілих жирових клітинах, де ліполіз регулюється не тільки катехоламінами, але й інсуліном. Однак необхідні подальші дослідження, щоб визначити, чи залежать відмінності в експресії від первинних відмінностей між типами клітин або через процедуру диференціації in vitro.
Підсумовуючи, ми показали, що функції α2A -AR та PDE3B відрізняються залежно від адипогенного походження дозрілих жирових клітин. Інгібування ліполізу α2A -AR та PDE3B представляється диференційовано важливим для адипоцитів, отриманих з різним клітинним походженням. Роль α2A -AR переважає в адипоцитах, отриманих hMSC, тоді як активність PDE3B переважає у зрілих адипоцитах. Обидва шляхи важливі для преадипоцитів. Ці сигнали можуть зіграти певну роль у накопиченні ліпідів під час дозрівання адипоцитів, щоб захистити незрілі жирові клітини, гальмуючи неконтрольоване виділення накопиченої енергії. Отримані нами результати вказують на те, що між людськими адипоцитами, отриманими з різних клітин-попередників, існують якісні відмінності, і слід проявляти обережність при інтерпретації результатів досліджень адипоцитів in vitro.
Дякую
Цю роботу підтримали фонди Åke Wiberg, Tore Nilsson, Signe and Olof Wallenius, Magnus Bergvall, Åhlens і Novo Nordisk, Шведська медична асоціація, Шведська наукова рада, Шведська асоціація діабету, Фонд Тобіаса та Шведський фонд раку .,