предметів
реферат
Характерно, що клітини раку простати (РПЖ) демонструють помітне зниження внутрішньоклітинного цинку; Однак відповідальний механізм не чітко зрозумілий. HOXB13 бере участь у прогресуванні РПЖ і надмірно експресується в стійкому до кастрації РПЖ. ДНК-аналіз мікрочипів LNCaP Pca показав, що транспортери виходу цинку ZnT помітно регулювались серед андроген-незалежних генів-мішеней HOXB13. Крім того, екзогенний HOXB13 спричиняв зменшення внутрішньоклітинних концентрацій цинку в клітинах PCa, стимулював опосередковану NF-κB сигналізацію за рахунок зменшення інгібітора NF-κB альфа (IκBα) та покращував транслокацію ядер RelA/p65. Пухлини передміхурової залози людини також продемонстрували сильну зворотну кореляцію між експресією білка HOXB13 та IκBa. Отже, HOXB13 стимулював інвазію клітин РПa, яка інгібувалась пригніченням ZnT4. Крім того, дослідження на моделі ортотопічної миші PC3 з метастазами PCa показали, що HOXB13 є потужним метастатичним стимулятором. У сукупності ці результати вказують на те, що HOXB13 сприяє інвазії РПa та метастазуванню, знижуючи внутрішньоклітинний рівень цинку, стимулюючи тим самим сигнали NF-κB, і припускають, що HOXB13 діє як модулятор внутрішньоклітинного рівня цинку, що сприяє злоякісним властивостям РПЖ.
У цьому дослідженні ми розглянули роль HOXB13 у опосередкованій цинком регуляції передачі сигналів NF-κB, щоб покращити наше розуміння участі HOXB13 у прогресуванні РПЖ до CRPC. Нормальна простата людини накопичує більш високий рівень цинку, ніж будь-яка інша м’яка тканина, і тому цинк вважається важливим компонентом здорової простати. Однак рівень цинку в пухлинах епітелію простати значно знижується і продовжує знижуватися під час прогресування до андроген-незалежного росту. У цьому дослідженні ми провели додатковий аналіз мікрочипів ДНК в клітинах LNCaP, вирощених в умовах андрогенних виснажень, щоб сформулювати андрогеннезалежні гени, націлені на HOXB13. Один із цих цільових генів, вихідний носій цинку ZnT4, детально аналізували, щоб виявити будь-яку зв'язок між HOXB13 та опосередкованими цинком каскадами біомолекул. Це дослідження було проведено, щоб визначити, як клітини передміхурової залози пристосовуються до виживання за допомогою туморогенезу та прогресування до клітин CRPC.
результат
ZnT4 (транспортер вихідного цинку) є ціллю HOXB13
ZnT4, транспортер вихідного цинку, є ціллю HOXB13. ( a ) Ієрархічний кластерний аналіз генів, диференційовано експресованих у клітинах LNCaP в умовах, що виснажені гормонами. Для вивчення цільових генів HOXB13 був проведений аналіз мікрочипів ДНК у фізіологічному стані, в якому HOXB13 (B1-B3) був мінімально надмірно експресованим в LNCaP порівняно з контролем (G1G3). На цьому зображенні червоно-зеленим кольором показані надрегульовані та зменшені транскрипти. Цей огляд відносних рівнів експресії генів, регульованих HOXB13, показує цільові гени, експресія яких змінилася принаймні вдвічі більше середньої кількості в контролі. ( b ) Експресія мРНК-транспортера цинку в клітинах LNCaP (верхня панель). Експресія HOXB13 контролювалася аденовірусом. Відображена експресія гена є засобом трьох незалежних RT-PCR-аналізів у реальному часі і представлена як середнє значення ± sd (нижня панель). ( c ) Експресія білка ZnT4 за допомогою вестерн-блот. Клітини HEK293 трансфікували гомоаміном, видаленим з pFLAG-HOXB13, pFLAG або pFLAG-HOXB13.
Повнорозмірне зображення
HOXB13 знижував внутрішньоклітинний рівень цинку та стимулював сигналізацію NF-κB у клітинах РПЖ
HOXB13 знижує внутрішньоклітинний рівень цинку та стимулює сигналізацію NF-κB у клітинах РПЖ. Клітини LNCaP-S4 вирощували в андрогенно-виснажених умовах протягом 3 днів і таким чином змушували експресувати HOXB13. LNCaP-shHOXB13 - це супресовані HOXB13 клітини. Клітини PC3 трансфікували Flag-HOXB13. Клітини LNCaP-S4 ( a ) або контрольні комірки Tet-on ( b ) обробляли Dox для індукування HOXB13. Клітини, пригнічені HOXB13 (1-3, 4-1), також використовували та порівнювали із змішаними клітинами ( c ). Клітини аналізували на вміст внутрішньоклітинного цинку. Після культивування клітин PC3 ( d ) або клітини LNCaP-S4 ( e ) TNF-α додавали протягом 24 годин для стимулювання активності NF-κB. Клітини LNCaP-S4 ( f ) або shHOXB13-LNCaP ( g ) попередньо інкубували з цинком та/або піритионом протягом 30 хвилин, а потім інкубували з TNF-α протягом 2 годин. Клітини оцінювали за допомогою аналізів на люциферазу. *** на схемі вказують на суттєві відмінності між двома групами, визначені двостороннім t-критерієм Стьюдента (P
Активація NF-κB HOXB13 опосередковується IκB. ( a ) Експресія HOXB13 індукувалась у клітинах LNCaP-S4 за допомогою Dox, а відповідні лізати збирали та вестерн-блот (ліва панель, цілі лізати; права панель, ядерні екстракти). ( b ) Клітини, пригнічені HOXB13 (1-3 та 4-1) та змішані контрольні клітини, оцінювали на експресію білка pNF-κB (ліва панель, цілий лізат, права панель, ядерні екстракти).
Повнорозмірне зображення
Експресія HOXB13 опосередковано корелювала з експресією IκBα при пухлинах простати
Оскільки HOXB13 регулював активність NF-κB за рахунок зменшення активності IκBα у клітинах РПa, ми оцінювали експресію тканин HOXB13 та IκBα в тканинах 9 CRPC та 12 андроген-залежних PCases (ADPC). Однак, оскільки РПЖ була гетерогенною, ми оцінювали лише клітини РПЖ з позитивним впливом на рецептор андрогену (AR). На Фігурі 5А показано експресію HOXB13 та IκBα, а також те, що пухлини, що надмірно експресують HOXB13, не експресують IκBα (a-d). Особливо це стосувалось CRPC, оскільки лише CRPC, що надмірно експресують HOXB13, не виражали IκBα. Кілька ADXP, що надмірно експресують HOXB13, експресували IκBα (e-h), тоді як деякі пухлинні клітини та клітини доброякісної гіперплазії передміхурової залози демонстрували низьку експресію HOXB13 та високий IκBα (i-1). Коли довільним і низьким доданкам було довільно присвоєно бал 2-3 або 0-1, показники HOXB13 та IκBα були обернено корельованими (χ 2 = 4, 888, P
Експресія HOXB13 опосередковано корелює з IκBα при пухлинах простати. ( A ) Імунофарбування проводили в різних тканинах передміхурової залози з використанням серійних зрізів. АР використовували як внутрішній контроль. Шкала становить 100 мкм. Вставки відображалися зі збільшенням x 40. ( B ) Гістограма, що відображає оцінки HOXB13 балів HOXB13 з надмірно вираженими та вираженими ПК. Оцінювали експресію HOXB13 та IκBa в пухлинах (0, відсутні, 1, слабкі, 2, помірні та 3 сильні). Зірочками позначено Р
HOXB13 збільшує інвазивний потенціал клітин РПЖ. ( a ) Інвазію клітин вимірювали за допомогою матригельного трансуеллу. Клітини, пригнічені HOXB13 (1-3 та 4-1) та змішані клітини вирощували в умовах, що виснажені андрогенами, протягом 2 днів. До нижчих камер додавали середовище, що містить фібронектин. Через 24 години клітини фарбували і знімали зображення. ( b ) Клітини підраховували у випадково обраних п’яти полях із збільшенням x 200; результати представлені у вигляді гістограми. ( c Індуковані доксом клітини HOXB13 S4 висівали, а потім трансфікували si-ZnT4 (50 нМ) або si-контрольні та трансфіковані клітини застосовували до аналізів інвазії, як описано вище. Тести проводились у трьох примірниках; стовпці представляють середні значення ± sd ( d ) клітини shHOXB13-LNCaP вирощували в умовах, що виснажені андрогенами, протягом 2 днів. Потім клітини екстрагували, а лізати оцінювали вестерн-блот. ( e ) Кондиціоноване середовище з клітин LNCaP-shHOXB13 (ліва панель) або клітин LNCaP-S4 (права панель) піддавали аналізу желатинової зимографії. Показані форми MMP-9 та MMP-2.
Повнорозмірне зображення
HOXB13 стимулював метастази клітин РРa в лімфатичні вузли
Метастази пухлин PC3-HOXB13 в пара-аортальні лімфатичні вузли. ( A ) Стабільно трансфіковані клітини PC3 імуноблотували для FLAG. ( B ) Параортальні лімфатичні вузли були розділені для виявлення метастазів і підраховано кількість метастазів. Частота метастазів у лімфатичні вузли миші становила 75,0% (шість з восьми мишей, що несли пухлину) у групі PC3-HOXB13 та 14,3% (одна з семи мишей, що несли пухлину) у групі PC3-імітації. ( C. ) Показані вибрані локальні (а - в) та метастатичні (г - е) пухлини PC3-HOXB13. Поля в "a" і "d" збільшені в "b" і "e". Серійні зрізи 'b' та 'e' були імуномічені для FLAG (c, f).
Повнорозмірне зображення
обговорення
Отримані нами результати свідчать про те, що HOXB13 в кінцевому підсумку стимулює інвазивні властивості клітин РПЖ шляхом зниження внутрішньоклітинного рівня цинку, особливо в умовах андрогенного виснаження. Ми пропонуємо гіпотетичну модель механізму дії HOXB13 під час інвазії PCa (рис. 8): (1) HOXB13 підвищує регуляцію каналів викиду цинку, включаючи ZnT4, в умовах, що виснажені андрогенами. (2) ZnT4 сприяє відтоку цинку з клітин. (3) Знижений рівень внутрішньоклітинного цинку стимулює експресію IKKα, що додатково фосфорилює та розкладає IκBα. (4) Вивільнений стимулюючий NF-κB, такий як p65 і p50, транслокується в ядро і активізує експресію генів, що беруть участь в інвазії та метастазуванні пухлинних клітин.
Гіпотетична модель інвазії РПЖ, опосередкованої HOXB13. Коли HOXB13 надмірно експресується при стійких до абляції раку передміхурової залози, ми пропонуємо, щоб HOXB13 функціонував, сприяючи інвазії ракових клітин наступним чином: (1) HOXB13 збільшує регуляцію каналів викиду цинку, включаючи Znt4, в умовах, виснажених андрогеном. (2) ZnT4 сприяє внутрішньоклітинному потоку цинку. (3) Знижений рівень внутрішньоклітинного цинку стимулює експресію IKKα, який фосфорилює та розкладає IκBα. (4) Вивільнений стимулюючий NF-κB, включаючи p65 і p50, транслокується в ядро і активізує експресію генів, що беруть участь в інвазії клітин пухлини.