пригнічує

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Асоціація рівнів холестерину ЛПВЩ у сироватці крові та адипокінів у осіб із абдомінальним ожирінням
  • HDL послаблює секрецію вісфатину та резистину, спричинену окси-LDL, у диференційованих 3T3-L1 адипоцитах
  • ЛПВЩ пригнічує накопичення вільного холестерину, викликаного LD-LDL, у цілих адипоцитах та в збагачених ER-мембранах
  • ЛПВЩ пригнічує секрецію вісфатину та індукованого оксидом LDL або ТМ резистину в адипоцитах 3T3-L1
  • HDL полегшує реакцію на стрес ER в адипоцитах 3T3-L1, індукованих ox-LDL або TM
  • HDL збільшує експресію рецептора поглинання типу I (SR-BI) та інгібує індуковане оксидом LDL накопичення FC через рецептор SR-BI в адипоцитах 3T3-L1
  • обговорення
  • методи
  • предметів
  • Аналіз сироватки
  • Культура клітин
  • Виділення та окислення ЛПНЩ
  • Вимірювання рівня адипокіну в середовищі
  • Фракціонування мембрани ER та визначення вільного холестерину (FC)
  • Вестерн-блот
  • Кількісна ПЛР в режимі реального часу
  • Проточна цитометрія
  • Мала трансфекція заважаючої РНК (siРНК)
  • Вимірювання ендотоксинів
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

реферат

З моменту появи адипоциту як "метаболічно активного органу", який виділяє гормони, цитокіни та хемокіни, зростає інтерес до розуміння його функцій при ожирінні та зниженні ваги 1. Жирова тканина виділяє кілька біоактивних молекул, званих адипокінами, таких як α-TNF (α) TNF-α, інтерлейкін-6 (IL-6) та білок хемоаттрактантів моноцитів (MCP-1) 2. Вісфатин і резистин - це нові адипокіни вісцеральної жирової тканини 3, 4. Хронічне запалення низького ступеня є визначною ознакою ожиріння при порушенні регуляції виробництва адипокіну, що походить від адипокіну. Вони виявляються як у сироватці, так і в жировій тканині і є активними факторами, що модулюють наслідки ожиріння та супутніх захворювань 5, 6 .

Щойно синтезовані мембранно-асоційовані секретовані білки належним чином збираються та збираються шаперонами в ендоплазматичному ретикулумі (ER) 7. Збій адаптаційної здатності ЕР призводить до активації стресу ЕР, також відомого як розвинена білкова реакція (УПО). Відомо, що стрес ЕР підвищений у печінці та жировій тканині ожирених мишей 8, 9 та ожиріння людей 10. Індукція стресу ER в жировій тканині модифікує секрецію адипокіну та індукує запалення 11. Недавні дослідження показали, що окислений ліпопротеїн низької щільності (ox-LDL) може сприяти експресії та секреції вісфатину та чинити опір, активуючи гомологічний білковий шлях ER-C/EBP (CHOP), що може бути пов'язано зі збільшенням холестерину. навантаження адипоцитів, тоді як тауроурсодезоксихолева кислота (TUDCA) захищає адипоцити від індукованої вол-ЛПНЩ секреції адипокіну, інгібуючи активацію ERS 12. Таким чином, можна припустити, що пригнічення стресу ЕР може бути ефективним підходом до модуляції секреції адипокінів, придушення запалення та зменшення ризику ожиріння та його ускладнень.

Загальновідомо, що ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) мають значні протизапальні та антиатерогенні властивості. Однак механізм, за допомогою якого ЛПВЩ запобігає атерогенезу, до кінця не з’ясований. Недавні дослідження показали сильну зв'язок між циркулюючим плазмовим резистином та атеросклерозом 13. ЛПВЩ може ще більше зменшити накопичення ліпідів в адипоцитах 14, що, ймовірно, може бути причиною сприятливого впливу ЛПВЩ на секрецію адипокінів. Тому ми висунули гіпотезу, що регулювання секреції адипокіну та накопичення ліпідів в адипоцитах за допомогою ЛПВЩ може сприяти його антиатерогенним властивостям. У цьому дослідженні ми досліджували вплив ЛПВЩ на секрецію адипокіну та накопичення ліпідів з акцентом на його роль у зменшенні регуляції ER-опосередкованого запалення-CHOP in vitro та in vivo. .

результат

Асоціація рівнів холестерину ЛПВЩ у сироватці крові та адипокінів у осіб із абдомінальним ожирінням

Основні демографічні дані щодо випробовуваних наведені в Додатковій таблиці 1. У дослідження було включено тридцять чотири пацієнти з абдомінальним ожирінням, а курців та тих, хто випив. Як показано на малюнку 1А, зафіксовано негативну кореляцію між рівнем вісфатину в сироватці та рівнем ХС-ЛПВЩ у сироватці крові. Така сама кореляція була виявлена ​​між HDL-C з резистином та TNF-α (рис. 1B, C).

Дослідження включало 34 випробуваних з абдомінальним ожирінням. ( A ) Діаграма розсіювання ЛПВЩ (ммоль/л) та вісфатину (нг/мл) з аналізом лінійної регресії. ( B ) Діаграма розсіювання ЛПВЩ (ммоль/л) та резистину (нг/мл) з аналізом лінійної регресії. ( C. ) Діаграма розсіювання ЛПВЩ (ммоль/л) і ФНО-α (нг/мл) з лінійним регресійним аналізом.

Повнорозмірне зображення

HDL послаблює секрецію вісфатину та резистину, спричинену окси-LDL, у диференційованих 3T3-L1 адипоцитах

На основі негативної кореляції ЛПВЩ-С та прозапальних адипокінів у пацієнтів із ожирінням було встановлено індуковану окси-ЛПНЩ модель запальних адипоцитів для дослідження захисної функції ЛПВЩ. Як показано на фіг. 2, інкубація адипоцитів з ox-LDL призвела до значного збільшення регуляції вивільнення вісфатину та резистину, тоді як підвищена регуляція суттєво послабилась залежно від дози попередньої обробки ЛПВЩ (рис. 2A, B) та залежно від часу (рис. 2C, D).

( A, B ) Адипоцити попередньо обробляли різними концентраціями ЛПВЩ у DMEM з 1% FBS протягом 2 годин, після чого інкубували з ox-LDL та 10 мкг/мл Sandoz 58035 протягом 48 годин, а потім визначали рівні вісфатину та резистину в клітинному середовищі. ІФА. ( C., D ) Адипоцити інкубували з ox-LDL та sandoz58035 (10 мкг/мл) протягом 48 годин у поєднанні з HDL (100 мкг/мл) протягом різного часу, а потім кількість вісфатину та резистину, що виділяються в клітинне середовище, визначали ІФА аналіз. Дані представлені як середнє значення ± SEM щонайменше шести незалежних експериментів. * P # P ## P

Адипоцити попередньо обробляли ЛПВЩ у DMEM з 1% FBS протягом 2 годин, після чого інкубували з ox-LDL та 10 мкг/мл Sandoz 58035 протягом 48 годин, а потім ( A ) Вміст FC у цілих клітинах аналізували за допомогою комерційного набору. ( B ) Збагачені ER мембрани з адипоцитів фракціонували центрифугуванням з градієнтом сахарози, як описано в розділі "Методи", і фракцію гранул тестували на вміст FC. Дані представлені як середнє значення ± SEM принаймні чотирьох незалежних експериментів. * P # P

( A, B Адипоцити попередньо обробляли ЛПВЩ або PBA в DMEM з 1% FBS протягом 2 годин з наступною інкубацією з ox-LDL та sandoz58035 (10 мкг/мл) протягом 48 годин. ( C., D ) Адипоцити попередньо обробляли ЛПВЩ або PBA в DMEM з 1% FBS протягом 2 годин з наступною інкубацією з ТМ та sandoz58035 (10 мкг/мл) протягом 24 годин. Рівні вісфатину та резистину в клітинному середовищі визначали методом ІФА. Дані виражаються як середнє значення ± SEM принаймні 5 незалежних експериментів. ** P # P

( A, B ) Адипоцити попередньо обробляли ЛПВЩ у DMEM з 1% FBS протягом 2 годин, після чого інкубували з ox-LDL та sandoz58035 (10 мкг/мл) протягом 48 годин, а потім ( A ) Рівень мРНК та білка SR-BI та PDZK1 оцінювали за допомогою ПЛР у реальному часі та вестерн-блоттінгу, і B ) експресію мембрани SR-BI вимірювали за допомогою проточної цитометрії. ( C. - F ) Адипоцити трансфікували siRNA проти SR-BI або siRNA негативного контролю протягом 48 годин, а потім клітини попередньо обробляли ЛПВЩ (100 мкг/мл) протягом 2 годин з наступною інкубацією з оксо-LDL (100 мкг/мл) і sandoz58035 (10 мкг/мл) протягом 48 годин. Потім мовчання SR-BI було підтверджено вестерн-блот ( C. ). Рівні ФК в адипоцитах ( D ) і багаті на ER фракції ( Е ) аналізували за допомогою комерційно доступного набору. Далі оцінювали рівень білка CHOP ( F ), маркер стресу ER, вестерн-блот. Дані виражаються як середнє значення ± SEM принаймні чотирьох незалежних експериментів. * P # P ## P & P

ЛПВЩ може пригнічувати індуковане оксидом LDL накопичення FC в адипоцитах за допомогою регуляції SR-BI, а згодом запобігати запаленню адипоцитів, опосередкованому ER-стрес-CHOP, індукованому ox-LDL.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Порушення гомеостазу холестерину в клітинах або організмах може призвести до посилення запальних реакцій. Хронічне запалення є важливим зв'язком між ожирінням та його патофізіологічними наслідками, включаючи атеросклероз, резистентність до інсуліну або розвиток раку 16. ЛПВЩ може захистити від розвитку атеросклеротичної ішемічної хвороби серця, частково сприяючи відтоку холестерину з макрофагів у стінці артерії. Крім того, він може виконувати протизапальну функцію в ендотеліальних клітинах та макрофагах 17. У цьому дослідженні ми демонструємо, що ЛПВЩ може пригнічувати індуковане оксидом LDL накопичення FC в адипоцитах за допомогою регуляції SR-BI, а згодом запобігати запаленню адипоцитів, спричиненому стресом-CHOP, спричиненим ox-LDL. Вперше ми підтверджуємо захисний ефект ЛПВЩ на запалення адипоцитів, що забезпечує важливий зв’язок між ожирінням та його ускладненнями. Наші висновки також, ймовірно, дадуть вказівки на те, що терапевтичні втручання, такі як збільшення виробництва або інфузії або поліпшення функції ЛПВЩ, можуть порушити зв'язок між накопиченням холестерину та запаленням жирової тканини та мати сприятливий ефект у пацієнтів із ожирінням та метаболічним синдромом.,

На закінчення це дослідження підтвердило негативний зв’язок між вмістом холестерину ЛПВЩ у сироватці крові та рівнями запального адипокіну у осіб з абдомінальним ожирінням. Ми показали, що ox-LDL стимулював експресію та секрецію вісфатину та резистину в адипоцитах 3T3-L1, активуючи ER-стрес. ЛПВЩ може пригнічувати індуковане волом-ЛПНЩ накопичення ФК в адипоцитах за допомогою регуляції SR-BI, а згодом запобігати запаленню адипоцитів, опосередкованому волівським стресом-СНОР, індукованим вол-ЛПНЩ. Ця знахідка, ймовірно, ще більше збагатить патофізіологію адипоцитів та пояснить сприятливий вплив ЛПВЩ на пов’язані з ожирінням запальні захворювання, такі як діабет чи атеросклероз.

методи

предметів

Усі експериментальні процедури були затверджені та виконувались згідно з інструкціями Комітету з етики Медичного університету Тайшань. Це поперечне дослідження включало 34 особи, які мали ожиріння живота у дорослих, які брали участь у медичних оглядах у лікарні для матері та дитини в районі Дайюе. Усі учасники надали письмову інформовану згоду на участь до участі у дослідженні.

Абдомінальне ожиріння (високий рівень тригліцеридів плюс окружність талії [HTGWC]) визначали як тригліцериди ≥1,7 ммоль/л та обхват талії ≥ 90 см (чоловіки) та ≥ 80 см (жінки). Ми виключили пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями, діабетом або гіполіпідемічними препаратами протягом 6 місяців до участі у дослідженні.

Аналіз сироватки

Зразки крові брали вранці після нічного голодування. Сироватка HDL-C, LDL-C, тригліцериди (TG) та глюкоза вимірювались ферментативними методами на хімічному автоаналізаторі (Hitachi Co 7600, Токіо, Японія). Рівні вісфатину, резистину та TNF-α у сироватці крові вимірювали за допомогою комерційного набору Elisa (Bluegene, Шанхай, Китай).

Культура клітин

Преадипоцити 3T3-L1, придбані в Американській колекції типових культур (ATCC), підтримували в DMEM (GIBCO) з додаванням 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS, Gibco), 2 мМ L-глутаміну та антибіотиків. Щоб викликати диференціювання адипоцитів, клітини попередньо культивували в базальному середовищі протягом 2 днів і давали їм вирости до місця злиття, а потім обробляли середовищем для диференціювання, що містить 10 мкг/мл інсуліну, 0,25 мкМ дексаметазону та 500 мкМ IBMX (середовище IDI) протягом 2 днів. з подальшою інкубацією в базальному середовищі, доповненому лише інсуліном, протягом 2 днів. Клітини додатково інкубували в базальному середовищі ще 2 дні. У той час понад 90% клітин накопичувало більше крапель ліпідів і було досягнуто диференціацію адипоцитів, що було виявлено за допомогою фарбування олійно-червоним О. Для експерименту клітини інкубували з DMEM + 0,2% BSA при 37 ° C протягом 12 годин а потім заповнювали FC інкубацією з повноцінним середовищем, що містить 10 мкг/мл інгібітора ACAT 58035 (сигма, США) плюс ox-LDL. за вказаний час.

Виділення та окислення ЛПНЩ

Людський ЛПНЩ був виділений та окислений, як нещодавно описано 34. Коротко, ЛПНЩ (щільність = 1019 - 1063 г/мл) виділяли з плазми донорів нормоліпідемії послідовним ультрацентрифугуванням та інкубували з 10 ммоль/л CuSO 4 протягом 18 годин при 37 ° C. Після інкубації додавали 0,1 ммоль./1 етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА) для запобігання подальшому окисленню, і окислений ЛПНЩ концентрували до 1 мг/мл. Ступінь окислення ЛПНЩ оцінювали на основі підвищеної рухливості агарозного гелю (порівняно з природним ЛПНЩ), а також на основі збільшення концентрації TBARS у зразку. Препарати з Ox-LDL зазвичай мали TBARS> 30 мкмоль/г білка та відносний індекс рухливості на агарозних гелях 2,0-2,5 порівняно з природним LDL. Ліпопротеїни зберігали при температурі 4 ° C у темряві та свіжо готували кожні два тижні.

Вимірювання рівня адипокіну в середовищі

Рівні вісфатину та резистину в клітинному середовищі визначали за допомогою тестових наборів Elisa (Bluegene, Шанхай, Китай) відповідно до інструкцій виробників.

Фракціонування мембрани ER та визначення вільного холестерину (FC)

Вестерн-блот

Клітинні або ядерні екстракти готували, як описано раніше 36. Потім їх піддавали вестерн-блот-аналізу з використанням PDO (Santa Cruz), bip (Abcam), фосфорильованого PERK (Santa Cruz), фосфорильованого eIF2a (Santa Cruz), ATF6 (Santa Cruz), histone H3 (Abcam), SR-BI ( Novus Biologicals), PDZK1 (Abcam) та β-актин (Sigma) антитіла. Білки візуалізували та кількісно визначали за допомогою посиленого методу хемілюмінесценції (Пірс) та кількісно визначали за допомогою системи візуалізації хемілюмінесценції (Bioshine Chemi Q 4800mini, Шанхай, Китай).

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Загальну клітинну РНК виділяли за допомогою реагенту TRIZOL (Invitrogen). Синтез CDNA проводили з використанням зворотної транскриптази MuLV (Applied Biosystems). ПЛР у реальному часі проводили за допомогою набору основних сумішей SYBR green PCR (TianGen Biotech). Праймери, що використовувались для ПЛР у реальному часі, були такими: SR-BI Forward ATCTGGTGGACAAATGGAA; SR-BI зворотний GAAGCGATACGTGGGAAT; PDZK1 Вперед TGACGGTGTGGTGGAAATG; PDZK1 Зворотний TGGCAGTAAAGAAGTGGAGAG; GAPDH Вперед TGACGTGCCGCCTGGAGA AA; Редакція GAPDH AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення роторного гена Q (Qiagen). Відносні рівні мРНК розраховували методом 2-DDCt .

Проточна цитометрія

Клітини фарбували 1 мкг/мл антитілом SR-BI протягом 60 хвилин. Після триразового промивання в PBS клітини ресуспендували у мічених FITC анти-кролячих антитілах. Після інкубації протягом 30 хвилин клітини тричі промивали крижаним PBS, а потім аналізували на проточному цитометрі (BD FACS Calibur).

Мала трансфекція заважаючої РНК (siРНК)

Клітини трансфікували специфічними олігомерами siRNA (80 нМ, Sigma, США), спрямованими проти SR-BI, використовуючи реагент для трансфекції Lipofectamine 2000 (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. Змішані олігомери siRNA використовували як негативний контроль. Після трансфекції протягом 48 годин клітини піддавали впливу ОХ-ЛПНЩ. Мовчання цільових генів було підтверджено вестерн-блот.

Вимірювання ендотоксинів

Вміст ендотоксину, присутній в ізольованому ЛПВЩ, вимірювали динамічними турбідиметричними методами на бактеріальному автоаналізаторі ендотоксинів (TDTF, BET-24A, Тяньцзінь, Китай).

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) та однофакторного та багатоваріантного логістичного регресійного аналізу за допомогою GraphPad Prism версії 4.0. Багаторазові порівняння між групами проводили за методом Тукі. Результати виражаються як середнє значення ± SEM. Значення Р менше 0,05 вважали значущими.

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Song, G. et al. Ліпопротеїн високої щільності інгібує індуковану оксидом LDL секрецію адипокіну, посилюючи регуляцію експресії SR-BI та пригнічуючи шлях стресу ER. Наук. Респ. 6, 30889; doi: 10, 1038/srep30889 (2016).

Додаткова інформація

Документи Word

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.