предметів

реферат

автентифікації

Географічне картографування видів Decalepis в Індії. Карти створювались за допомогою інструментів у Google Планета Земля Версії 7.1.7.2606 (http://www.neowin.net/news/google-earth-pro-7172606) на основі записаних координат GPS (Garmin) у пунктах збору.

Повнорозмірне зображення

У нашому недавньому дослідженні для оцінки генетичного різноманіття та структури популяції у диких популяціях D. arayalpathra на основі демографічного дослідження та генетичних даних маркерних тестів ми продемонстрували низьке генетичне різноманіття та високу генетичну диференціацію між популяціями 16. Крім того, було встановлено, що популяції мають обмежене поширення та високу фрагментацію, і виявилось, що вони надмірно експлуатуються внаслідок руйнівних урожаїв. Широка специфічність, пошкодження плодовими осами, вузький статус популяції, обмежений потік генів та грибкова коренева гниль - все це фактори, які загрожують цій групі в природному середовищі існування 16, 17. Це сигналізує про необхідність визнання таксонів у гарячих точках біорізноманіття, що є ключовим фактором забезпечення дотримання правил захисту рослин та майбутнього захисту видів 18 .

На сьогоднішній день багато дослідників оцінили поєднання декількох запропонованих пластидних і ядерних регіонів, щоб провести їх всебічне дослідження в таксономічно складних групах 24, 25, 27, 29, 34, 35, 36. В даний час дослідження штрих-коду виходить за межі цієї фази оцінки. На додаток до практичного застосування, яке забезпечує знання таксономії на видовому рівні, ця технологія визнана ефективним інструментом, забезпечуючи складну дискримінаційну силу для комерційних видів (перелік CITES), судово-медичну ідентифікацію та екологічний криміналістичний аналіз, а також ідентифікацію видів для рідкісні види. зникаючі та зникаючі групи рослин 37, 38, 39. Потенціал ДНК-штрих-кодів для ідентифікації виду навіть з невеликої кількості тканини (замість цілої рослини, бажано на етапі цвітіння, як вимагають сучасні таксономічні методи) розширює набір таксономічних інструментів шляхом боротьби з незаконною торгівлею зникаючими видами.

За відсутності єдиного консенсусу щодо універсального рослинного штрих-коду необхідно визначити оптимальний регіон (регіони) відповідно до таксонів, що цікавлять. Пошук правильного штрих-коду для роду Decalepis повністю відсутній. Тому це дослідження було розроблене для створення першої в історії довідкової бібліотеки, яка використовує найефективніші штрих-коди для забезпечення молекулярної ідентичності зникаючих та ендемічних видів Decalepis. Ефективність різних аналітичних підходів до даних штрихового кодування ДНК буде оцінена для перевірки роздільної здатності вибраних маркерів для Декалеписа. Результати цього дослідження, підтверджені динамікою популяції, запропонованою в нашому нещодавно опублікованому дослідженні 16, забезпечать цінні інструменти, необхідні для встановлення стандартного протоколу для каталогізації ідентифікації видів в рамках СІТЕС та розробки планів збереження для управління вимираючими видами. цієї групи.

результат

Успіх ампліфікації та послідовності ПЛР

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Аналіз відстані та області штрих-коду для ідентифікації видів

Графік штрих-коду для п'яти окремих штрих-кодів. Відстані до найближчого сусіда (NN) та максимальні внутрішньоспецифічні відстані (%), реалізовані Кімурою-2 (K2P), були побудовані для дискримінації видів. Кожна крапка представляє одну або кілька особин, оскільки вони мають однакові значення внутрішньо специфічної та міжспецифічної відстаней. Крапки над рядком 1: 1 вказували на наявність штрих-коду.

Повнорозмірне зображення

Оцінка прогалин штрих-кодів для вигідних комбінацій штрих-кодів Decalepis. Відстані до найближчого сусіда (NN) будували графіком щодо максимальних внутрішньоспецифічних відстаней параметра Кімура-2 (K2P) (%). Кожна крапка представляє одну або кілька особин, оскільки вони мають однакові значення внутрішньо специфічної та міжспецифічної відстаней. Крапки над рядком 1: 1 вказували на наявність штрих-коду.

Повнорозмірне зображення

Філогенетичний аналіз видів Decalepis на основі методу парсимона

Для оцінки еволюційних відмінностей між видами Decalepis ми використовували методи відстані (NJ) та характеру (MP) у всіх областях штрих-кодів. Результати підходу, заснованого на критеріях, перевершили метод NJ, заснований на відстані у розподілі окремих символів дерева. Оскільки функції методів NJ зменшуються до відстаней, які іноді втрачаються при попарному порівнянні та призводять до нерівних відстаней, подальший аналіз проводився із використанням моделі MP у PAUP.

Дерево суворого консенсусу, що показує взаємозв'язок видів Decalepis, що є результатом аналізу максимальної окупності за допомогою штрих-коду rbcL + matK + ITS. Довжина дерева = 146, CI = 85%, Ri = 91, RC = 78%. Значення підтримки завантажувальної системи нижче 60% не відображаються. Особи, що відповідають видам монофілів: червоний: D. arayalpathra, зелений: D. salicifolia, синій: D. hamiltonii .

Повнорозмірне зображення

Порівняння дискримінантних методів та ділянок штрих-кодів

Стіл в натуральну величину

На основі порівняння методів як підходи TaxonDNA, так і BLOG виконували однаково добре в середньому у всіх сприятливих штрих-кодах (обидва забезпечували правильну ідентифікацію на 75–100%). Однак коефіцієнт помилкової ідентифікації всіх локусів становив 0% у TaxonDNA, але 25% у BLOG (таблиця 3, виділена сірим кольором). На відміну від цього, BLOG перевершив TaxonDNA в результаті отриманих 0% осіб як "неідентифікованих", тоді як

11, 76% осіб не були ідентифіковані в TaxonDNA. Філогенетичний аналіз видів Decalepis на основі характерного підходу також призвів до присвоєння окремих рис дерев. Таким чином, функціональні, а не дистанційні методи є хорошим вибором для перевірки гіпотез.

обговорення

Ефективність регіонів штрих-коду у з'ясуванні молекулярної ідентичності видів Decalepis

Це дослідження є першою опублікованою спробою описати молекулярний філогенез зникаючих та зникаючих видів Decalepis. Це показує, що маркери зі штрих-кодом можуть точно розрізняти види, виявляючи однорідні плаки високої роздільної здатності на рівні видів (рис. 4). Із перевірених пластидних та ядерних локусів ІТС мав найвищу ефективність як єдиний локус для ідентифікації видів у Декалепісі (рис. S3). Висока кількість копій генів рРНК, більша дискримінантна сила на низьких таксономічних рівнях та вища швидкість еволюції роблять ІТС перспективним локусом у молекулярній системі рослин 40. Покращена філогенетична сигналізація ІТС у порівнянні з пластидними маркерами штрих-коду в Decalepis сумісна з результатами інших досліджень на рівні роду в Passiflora 41, Euphorbia 42, Paeonia 43 та Melilotus 44, серед інших.

І штрих-коди rbcL, і psbA-trnH мали найнижчу дискримінантну силу, оскільки єдиний локус, який обмежує їх корисність у Декалепісі, незважаючи на їх значення для штрих-кодів інших рослинних груп 20, 24. Обидві області не могли розрізнити види, і філогенетичне дерево, що утворилося, показало величезне перебільшення особин із поганою підтримкою клади. Було виявлено, що потенційна заміна, H. indicus, згрупована з D. hamiltonii та D. salicifolia, невирішена на основі дерева (рис. S3). Проблеми неоднозначності та частих інверсій, пов'язаних з паліндромними послідовностями в області psbA-trnH, були знайдені в декількох рядках покритонасінних рослин і, можливо, ускладнюють його використання в якості штрих-коду, особливо якщо вони трапляються в межах видів 29. Придатність області хлоропласту rbcL для видових еволюційних досліджень молекулярної еволюції була суперечливою, частково через її довжину

1430 п.н. Для чіткої дискримінації видів необхідно провести послідовність усього регіону, що обмежує його використання в якості послідовності штрих-кодів. Ідеальна область штрихового кодування повинна бути достатньо короткою для посилення та аналізу шляхом однопрохідного секвенування 35. Однак додавання в область інших маркерів штрих-коду покращує їх здатність розрізняти, як було показано в попередніх дослідженнях 29, 31, 35, 45 .

Область кодування хлоропластового matK представляла кращі коди кандидатів, ніж штрих-код кандидата, демонструючи як високе відновлення послідовності, так і високий ступінь ідентифікації або як єдиний локус, або в поєднанні з ITS. Комбінація matK + ITS обрамляла цілі сестринські види Decalepis як основне скупчення, причому H. indicus розташовувався як зовнішня група у вузловій гілці біля основи дерева (рис. 4). Материнський хлоропластний ген показав вищу швидкість заміщення нуклеотидів, ніж інші локуси, протестовані з генома пластиди, що забезпечувало більш високі міжспецифічні значення розбіжності між послідовностями matK. Ядерна комбінація двох штрих-кодів локусу ITS + ITS2 також показала дуже подібний результат, що підтверджує перевагу підходу багатоканального консенсусного штрих-коду в штриховому кодуванні рослинної ДНК.

Доцільність аналітичних методів для забезпечення чіткої дискримінації видів Decalepis

$ config [ads_text16] не знайдено

Серед трьох різних модулів ("BM", "BCM" та "Всі типи штрих-кодів"), реалізованих у TaxonDNA, комбінований штрих-код rbcL + matK + ITS правильно визначив 15 видів

Застосування інструментів штрих-коду в захисті Decalepis

висновок

Це дослідження наочно демонструє ефективність кодування ДНК у виявленні ендемічних видів. Послідовності сигнатур пропонованого штрих-коду rbcL + matK + ITS забезпечували точні сигнали для полегшення молекулярної ідентичності видів Decalepis, що узгоджується з його останнім таксономічним переглядом. Регіон чітко обрамлив весь набір сестринських видів Decalepis як основне скупчення, з потенційним заміщенням H. indicus у зовнішній групі, розташованій як вузлова гілка біля основи дерева. Характерний підхід за допомогою PAUP та BLOG успішно виділив 100% досліджуваних зразків, зробивши їх точність та надійність методом вибору в дослідженнях штрихового кодування ДНК. Видоспецифічні аналізи, отримані з послідовностей кодуючої області кодуючої області matK, ще більше підтверджують його значення у забезпеченні точного методу видової дискримінації. Очікується, що включення різних специфічних популяцій отримає розуміння стану збереження видів гарячих точок Decalepis, а також підкреслить практичне застосування штрихового кодування ДНК як інструменту збереження біорізноманіття ендемічних та зникаючих рослинних груп.

Матеріали і методи

Вибірка таксонів та етичне твердження

З різних географічних районів Тамілнаду, Керали та Карнатаки було зібрано 15 особин, що належать до трьох різних видів Decalepis. Дві особини від H. indicus були зібрані з Тамілнаду та Карнатаки (рис. 1). Зразки сушили на силікагелі та зберігали при -20 ° C перед вилученням ДНК. Зразки ваучерів для кожного виду, відібрані в рамках цього дослідження, зберігались у гербарії Фонду відродження місцевих традицій охорони здоров’я (FRLHT), Бангалор, Індія та Центральний інститут CSIR - лікарські та ароматичні рослини (CIMAP), Лакхнау, Індія. посилання та відповідні деталі наведені в таблиці 2.

Молекулярні методи

Загальну ДНК геному виділяли з еталонних зразків, використовуючи протокол цетилтриметиламмоній броміду (CTAB) 57. Ізольовану ДНК перевіряли на якість та кількість методом електрофорезу в 0,8% агарозному гелі та спектрофотометричного аналізу (NanoDrop, ND-1000, США). ДНК розводили до кінцевої концентрації

25 - 50 нг/мкл для ампліфікації ПЛР. П'ять кандидатних локусів штрих-коду ДНК ампліфікували встановленими праймерами, які включали два кодуючих локуси cpDNA, rbcL та matK; один некодуючий розпірник міжгенного локусу cpDNA, psbA-trnH та ДНК, ITS та ITS2 локуси. Детальна інформація про праймери та умови ПЛР наведені в таблиці SI. Ампліфікацію ПЛР для кожного набору праймерів проводили в обсязі 50 мкл, що містив 1X Taq буфер ДНК-полімерази, по 200 мкМ кожен dNTP (dATP: dTTP: dCTP: dGTP порціями 1: 1: 1: 1), по 5-10 пмоль кожен. праймер (вперед і назад), 1 одиниця ДНК-полімерази Taq a

25-50 нг матричної ДНК. Успішні амплікони аналізували електрофорезом на 2% агарозному гелі. Згодом продукти цільової молекулярної маси очищали за допомогою набору для очищення ПЛР Nucleospin, використовуючи протокол виробника (MACHEREY-NAGEL - 07/2014, Rev.03) і повторно перевіряли за допомогою електрофорезу на 2% агарозному гелі. Отриманий продукт піддавали реакціям диоксисеквенування секвенсінгу Сангера у прямому та зворотному напрямках із використанням комплекту послідовності циклів BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) на генетичному аналізаторі ABI 3130 XL (Applied Biosystems).

База даних

Зразки даних для кожного регіону були депоновані в Штрих-коді систем життєвих даних (BOLD) 58 (//www.boldsystems.org) у рамках проекту CRCB - «ДНК-штрих-кодування в Decalepis» (Таблиця 2). Усі дані доступні на BOLD під набором даних DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB). Послідовності були передані GenBank і є загальнодоступними за номерами приєднання, вказаними в Таблиці 2.

Аналіз даних

Електроферограми, отримані для кожної області, в основному називали за допомогою PHRED; послідовності, зібрані та модифіковані за допомогою Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA). Нарешті, послідовності піддавали бластуванню до NCBI BLAST в рамках програми BLASTN 2.2.1+ 59, 60 і далі до BOLD, використовуючи запит Ідентифікації, щоб перевірити їх гомологію з іншими доступними послідовностями. Усі послідовності штрих-кодів мали довжину понад 500 п.н. і не забруднювали. Потім модифіковані послідовності вирівнювали з м’язом 3.8.31 на веб-сайті EMBLEBI (//www.ebi.ac.uk) за параметрами за замовчуванням та вручну модифікували у BioEdit v7.1.3.0 61. Послідовності були усічені на обох кінцях, щоб видалити послідовності праймерів. Усі змінні сайту перевірялись за допомогою оригінальних файлів відстеження. Примирення можна отримати у відповідного автора за обґрунтованим запитом. П'ять кандидатів-локусів ДНК-штрих-коду та їх 26 можливих комбінацій, а також багатоступінчастий підхід поступового штрих-кодування оцінювали на основі методів, описаних вище.

Аналіз прогалин на основі штрих-кодів

Доступ символів через БЛОГ

Штрих-кодування за допомогою LOGic (BLOG) - це підхід до машинного навчання з використанням BLOG2.0 для класифікації послідовностей зразків за видами, використовуючи набір правил класифікації для розташування ключових штрих-кодів ДНК для діагностичних нуклеотидів 66, 67. Він формулює правила класифікації на основі наданого набору навчальних даних, а потім застосовує те саме до навчального набору та набору тестів для оцінки успіху ідентифікації. Різні набори даних штрих-коду, що використовувались у цьому дослідженні, піддавали нарізуванню 90% видів з максимальним числом ітерацій 500 (GRASPITER = 500) та максимальним часом аналізу 5 хвилин (GRASPSECS = 300). За основу ідентифікації була взята логічна формула з найнижчим коефіцієнтом хибнопозитивних порівняно з набором контрольних даних.

Філогенетичні дерева з використанням методів, заснованих на відстані та характері

Для визначення виду на дискретні клади або монофілетичні групи був проведений філогенетичний аналіз на вивчених наборах даних. Процес розробки даних послідовності оцінювався на основі методів, заснованих на відстані та характері. Для розрахунку еволюційної відстані між послідовностями використовували сусідній алгоритм кластеризації з мінімальним еволюційним (NJ). Дерева Нью-Джерсі були побудовані в PAUP 4.0 68 на основі відстаней K2P як генетичне вимірювання та встановлення нульової довжини гілок до нуля.

Серед підходів, що базуються на характері, для визначення найбільш вірогідної історії еволюційних подій між послідовностями використовували метод максимального парсимону (MP). Аналіз MP проводили в PAUP 4.0 з використанням моделі заміщення HKY-гамми для врахування зміни швидкості між ділянками. Початковий евристичний пошук виконували з 1000 реплік, а обмін гілками проводили за допомогою бісекції-повторного підключення (TBR). На кожному кроці було проведено максимум 10 дерев із випадковими послідовними додаваннями для початкового дерева у кожному повторенні. Дерева в першому турі були піддані другому пошуку шляхом обміну TBR потужністю до 15000 дерев та обміну для добудови. Надійність вузла оцінювали за допомогою тесту завантаження з 1000 псевдореплікатами 69, 70, 71. H. indicus використовувався як допоміжна група для всіх методів.

Наявність даних

GenBank (NCBI) [//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank] Номери приєднання для нуклеотидних послідовностей наведені в таблиці 2. Вирівнювання послідовностей було заархівовано в проекті BOLD [//www.boldsystems.org] DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB).

Дякую

Автори вдячні директору, CSIR-CIMAP, Лакхнау, за його заохочення та надання лабораторних приміщень для дослідження. Фінансова підтримка Ради з науково-промислових досліджень (CSIR), Нью-Делі, Індія до XII. Проекти FYP Biopros-PR (BSC-0106) та ChemBio (BSC-0203) вдячні.

Електронний додатковий матеріал

Штрих-кодування на основі символів для автентифікації та збереження IUCN Вимираючі види роду Decalepis (Apocynaceae) \ t

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.