предметів

реферат

Передумови

У дітей із ціанотичною хворобою серця через невідомі механізми розвивається вторинний еритроцитоз та тромбоцитопенія. Зрілі мікроцити еритроцитів можуть відображати клінічні патології та процеси попередньої ядерної диференціації клітин. У цьому дослідженні оцінювали мікроРНК еритроцитів у дітей із ціанотичною хворобою серця.

методи

МікроРНК еритроцитів у дітей із ціанотичною та ацианотичною хворобами серця та без неї була визначена кількісно за допомогою системи ІОН PGM (n = 10 на групу). Диференціальна експресія була підтверджена кількісною ПЛР (qPCR; n = 20 на групу).

результат

Mir-486-3p, mir-486-5p та mir-155-5p були збільшені у пацієнтів із ціанотичною хворобою серця порівняно з пацієнтами без серцевих захворювань: множинні відмінності (95% довірчий інтервал): mir-486-3p: 1, 92 (1, 14 –3, 23), P = 0, 011; mir-486-5p: 2, 27 (1, 41–3, 65), клітини Р 108 з використанням повного аналізу крові. Діапазон розмірів мікроРНК підтверджено, і кількісно визначено 2 нг РНК за допомогою біоаналізатора та набору Agilent Small RNA (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія).

Додаткові бібліотеки ДНК були побудовані з використанням набору Ion Torrent RNA-seq v.2 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) для невеликих бібліотек РНК відповідно до інструкцій виробника, а їх чистота та концентрація були підтверджені за допомогою біоаналізатора з набором Agilent DNA (Agilent Технології).

Послідовність бібліотек MicroRNA проводили на чіпі 318 із використанням системи Ion Personal Genome Machine (ThermoFisher Scientific). Всі необроблені зчитування були автоматично обрізані для видалення адаптерів, вирівняні до людського геному (hg19 GRCh37) та анотовані Torrent Suite 1.5 (TMAP) із параметрами за замовчуванням. Малі та некодуючі РНК класифікували за типами генів. Ми визначили послідовності за допомогою бази даних мікроРНК miRBase 21 (//www/mirbase.org/).

Виділення загальної РНК та qPCR (фаза валідації)

Ми провели qPCR для визначення зрілої мікроРНК та перевірки результатів послідовності наступного покоління. Загальну РНК екстрагували з 2,7 мл клітин крові пацієнта за допомогою міні-набору RNeasy Plus та набору для очищення RNeasy MinElute (Qiagen) відповідно до інструкцій виробника. Кількісно визначали РНК з 1,0 х 108 клітин за допомогою флуорометра Quantus (Promega KK, Токіо, Японія), і концентрація кожного зразка становила 0,2 нг/мкл. Невеликі молекули РНК, 5'-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3 ', збагачувались зразками та використовували як контроль.

Комплементарну ДНК готували за допомогою набору ABI Taqman для вдосконаленого комплементарного синтезу ДНК мікроРНК (ThermoFisher Scientific). Аналіз qPCR проводили за допомогою Step One Plus (ThermoFisher Scientific). На порозі циклу було використано 40-кратний коефіцієнт посилення (значення Ct = 40). Ми виключили мікроРНК із групових порівнянь, коли в групі спостерігали невизначені зразки (значення Ct> 40), що перевищували три зразки. Для аналізу значень виразів використовували метод ACCt.

Статистичний аналіз

Емпіричний аналіз цифрової експресії генів за допомогою CLC Genomic Workbench версії 8.5.1 (Qiagen) був використаний для порівняння результатів експресії мікроРНК із послідовності наступного покоління. Значення P, виправлені на помилкові висновки (значення FDR-P) менше 0,05, вважалися значущими в аналізі.

Значення експресії qPCR порівнювали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу, що супроводжувався пост-хок аналізом Тукі. Тригрупові змінні піддавали звичайному тестуванню для визначення розподілу даних. Зазвичай розподілені дані виражаються як середні (SD), а нестандартно розподілені дані - як медіана першого та третього квартилів (квартиль 1 та квартиль 3). Змінні аналізували за допомогою тесту множинного порівняння Тукі для нормально розподілених даних та тесту Данна для нормально розподілених даних. Значення Р менше 0,05 вважали значущими. Статистичний аналіз проводили з використанням Stat-Flex версії 6.0 (Artech, Осака, Японія) та Graph Pad Prism 7.00 (Graphpad Software, La Jolla, CA).

Ми підрахували, що 10 пацієнтів на групу відповідали обсягу вибірки для дослідницької фази на основі попереднього дослідження (20, 21). Оцінка розміру вибірки для фази перевірки qPCR базувалася на a = 0,05, β = 0,2 і розмірі ефекту = 0,5, для трьох груп, використовуючи потужність G * 3.1.9.2 (//www.gpower.hhu. De /) . Потрібно було чотирнадцять пацієнтів на групу. Тому ми включили до групи 20 пацієнтів.

результат

Послідовність наступного покоління (фаза розвідки)

Стіл в натуральну величину

внесок

Вулканічний графік порівняння кожної групи та теплова карта трьох груп. ( a ) Повідомляються назви мікроРНК із скоригованими FDR значеннями P (значення FDR-P) менше 0,05. МікроРНК були розпізнані як послідовності петлі деформації. Для mir-1260a та mir-1260b петлі стебла та зрілі послідовності демонстрували відповідність один до одного. Базою даних мікроРНК була miRBase 21 (//www/mirbase.org/). ( b ) Вся карта тепла показана праворуч. Область високого вираження розширена ліворуч. Mir-486-1 і mir-486-2 чітко демонструють контраст у ціанотичних вроджених вадах серця та вроджених вадах серця у порівнянні з контрольною групою. FDR, помилкова знахідка.

Повнорозмірне зображення

qPCR (фаза верифікації)

Стіл в натуральну величину

Диференціальні мікроРНК у порівнянні трьох груп, підтверджені qPCR. Mir-486-3p, mir-486-5p та mir-155-5p були значно збільшені в групі ціанотичних вроджених вад серця. * Р + клітини (перед гемопоетичною диференціацією) та інгібує пригнічення нормальних клітин CD34 + in vitro та in vivo (23). Вважається, що підвищений рівень mir-486-5p є механізмом компенсації хронічної тканинної гіпоксії за рахунок збільшення циркулюючих гемоцитів. Діти з ацианотичною хворобою серця не мали короткого перебігу справа наліво, але часто страждали хронічною гіпоксією тканин через системну гіпоперфузію, спричинену короткочасністю зліва направо. Отже, збільшення як циркулюючих гемоцитів, так і об’єму крові може бути більш вигідним як компенсаторний механізм підвищення мір-486-3р та мір-155-5р (нижче за течією від гемопоетичної диференціації) за наявності вроджених вад серця. Як результат, це відповідає тенденції, згідно з якою у дітей з ацианотичною хворобою серця, як правило, не розвивається еритроцитоз або тромбоцитопенія (4).

Мір-155 - це мікроРНК, індукована гіпоксією (24, 25). Він модулює мегакаріопоез, а його надмірна експресія пригнічує диференціацію мегакаріоцитів, регулюючи фактори транскрипції Meis-1 та Ets-1 (26). Тому надмірна експресія mir-155 може пояснити еритроцитоз та тромбоцитопенію у дітей із ціанотичною хворобою серця. Відомо, що Mir-155 регулює гексокіназу II, і його збільшення сприяє виробленню гексокінази II та білків (27). Анаеробний гліколіз в основному забезпечує еритроцити енергією, оскільки мітохондрії видаляються з ретикулоцитів на останній стадії диференціації еритроцитів (28).

Цікаво, що mir-155 не тільки сприяє еритроцитозу, але й анаеробному гліколізу в еритроцитах, що, в свою чергу, сприяє адаптації до гіпоксії. Крім того, mir-155 експресується в лімфоцитах, ендотеліальних клітинах і клітинах гладких м'язів (29, 30, 31). Нещодавно було показано, що mir-155 виконує як антиангіогенну, так і проартеріогенну функції через рецептор ангіотензину II типу 1 в ендотеліальних клітинах і супресор сигнального рецептора 1 до цитокінів у макрофагах (32). Коли у дітей із ціанотичною хворобою серця розвивається колатеральний кровообіг, такий як головна аортолегенева колатеральна артерія, mir-155 може сприяти неоваскуляризації.

Хоча були запропоновані пояснення патологічних станів ціанотичної хвороби серця, механізм залишається незрозумілим (4, 33, 34, 35). Механізм, пов’язаний з мікроРНК, за участю mir-486-3p, mir-486-5p та mir-155-5p, може бути найбільш підходящим поясненням на сьогодні. Це підтверджується тим фактом, що зниження кількості сітчастих тромбоцитів при вроджених ціанотичних вадах серця, незважаючи на нормальний рівень тромбопоетину (4) та посилений еритропоез, зберігається і після початкового підвищення рівня еритропоетину (6). У мишей нещодавно було показано, що легені є ще одним основним місцем кінцевої продукції тромбоцитів, де мегакаріоцити мігрують з кісткового мозку і вивільняють тромбоцити (36). Отже, правобічне коротке замикання викликає «коротке замикання» мегакаріоцитів і може прискорити тромбоцитопенію (рис. 3).

Схема можливого механізму аномалій крові при вроджених вадах серця. Збільшення mir-486-5p збільшує диференціювання клітин CD34 + (вище за течією гемопоетичної диференціації). Збільшення mir-486-3p та mir-155-5p індукує диференціювання клітин-попередників мегакаріоцитів та клітин-попередників еритроїдів (нижче за течією від гемопоетичної диференціації). Право-ліве коротке замикання викликає "коротке замикання" мегакаріоцитів і може прискорити тромбоцитопенію (36).

Повнорозмірне зображення

Попередні дослідження показали, що хронічна гіпоксія пригнічує експресію та активність Dicer, який переробляє мікроРНК-попередники у їх зрілі форми (37, 38, 39). Таким чином, експресія зрілих мікроРНК, як правило, зменшувалась із накопиченням попередніх мікроРНК при хронічній гіпоксії. На відміну від цього, як mir-155, так і pre-mir-155 збільшуються при гіпоксії та збиванні Dicer (27); mir-486-3p та -5p можуть поводитись аналогічно в цьому дослідженні. Здається, Residual Dicer переважно обробляє такі пре-мікроРНК, інакше їх деградація затримається при гіпоксії, але детальний механізм залишається незрозумілим (27).

Також залишається незрозумілим, чи mir-1260a та let-7e-5p, які були знижені у дітей з ацикотичною хворобою серця, сприяють диференціації клітин крові. Нижнє регулювання циркулюючого let-7e-5p було виявлено у пацієнтів з дефектами міжшлуночкової перегородки, що свідчить про те, що він відіграє регулюючу роль у розвитку дефектів міжшлуночкової перегородки (40). Більшість пацієнтів з ацианотичною групою брали участь у цьому дослідженні пацієнтів з дефектом міжшлуночкової перегородки, і зниження регуляції let-7e-5p також може спостерігатися в еритроцитах. Ми підсумували гени, пов’язані з диференціацією клітин крові, які є передбачуваними мішенями мікроРНК для підтримки подальших досліджень (Таблиця 3).

Стіл в натуральну величину

Обмеження цього дослідження полягає в тому, що воно було суто спостережливим. Ми не проводили функціонального аналізу значущих мікроРНК, які могли б надати прямі докази патологій крові, що виникають у ціанотичних пацієнтів. Тому необхідні подальші дослідження для з’ясування складного механізму поєднання мікроРНК. Mir-155-3p, mir-140-5p та mir-296 (-3p та -5p) були виключені з порівняння трьох груп qPCR для статистичної точності, оскільки кілька зразків мали невизначені значення Ct (значення Ct> 40) . Може бути вигідніше змінити поріг Ct для виявлення цих мікроРНК. Майже половина зразків mir-140-5p у контрольній та ацианотичній групах не досягла порогу, хоча спостерігалася крива ампліфікації. Це може бути пов’язано з тим, що рівень mir-140-5p, як правило, був низьким і його важко було виявити за непатологічних умов. Для таких мікроРНК генерація послідовностей послідовностей наступного покоління може допомогти визначити зміни слідів.

Іншим обмеженням є те, що тривалість та ступінь ціанозу варіювали серед залучених хворих ціанотиками, що могло вплинути на вироблення мікроРНК. Ступінь тромбоцитопенії та еритроцитозу насправді не були серйозними у нашій ціанотичній групі. Це може бути пов'язано з хірургічними втручаннями, проведеними раніше, ніж раніше було описано (4, 33, 34, 41), тим самим обмежуючи тривалість хронічної гіпоксії, що відповідає значному збільшенню mir-155, індукованої гіпоксією мікроРНК, у послідовності наступних генерація та qPCR. Крім того, більш рання операція може призвести до того, що пацієнти, які входять до ціанотичної та ацианотичної груп, молодші за пацієнтів контрольної групи. Крім того, mir-486-5p продемонстрував значні зміни у дітей із ціанотичною хворобою серця. Збільшення нормальних клітин CD34 + та еритроїдна диференціація mir-486-5p може замаскувати ефект інгібування диференціації мегакаріоцитів mir-486-3p та mir-155-5p. Нарешті, ретикулоцити в цьому дослідженні не видаляли, хоча ці цифри були однаковими у всіх трьох групах.

Нарешті, рівні експресії декількох мікроРНК в еритроцитах значно підвищувались або зменшувались у дітей із ціанотичною та ацианотичною хворобами серця. Кілька форм, включаючи mir-486-3p, mir-486-5p та mir-155-5p, можуть сприяти розвитку вторинного еритроцитозу та тромбоцитопенії у дітей ціанотичного типу після гіпоксії.

Додаткова інформація

Документи Word

Додаткова таблиця S1

Додаткова таблиця S2

ВНОСИ АВТОРА

NM and Yo.N.: Дизайн дослідження, набір пацієнтів, збір даних, аналіз даних та написання початкового проекту рукопису; SM, TM, TS та Ya.N.: Дизайн дослідження, інтерпретація даних та написання оригінального рукопису; ТТ: вивчення дизайну та розробка оригінального дизайну рукопису; DIS: дизайн дослідження (нагляд за статистичним підходом) та критичний перегляд рукопису для важливого інтелектуального змісту; SI, SO та NT: набір пацієнтів, збір даних та початкове написання рукописів.

Звіт про фінансову підтримку

Ця робота була частково підтримана грантами на підтримку наукових досліджень Міністерства освіти, культури, спорту, науки та технологій Японії (№ 26462370, 15K21287, 15K10542 та 17K11093).