рівні

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • обговорення
  • методи
  • Клітинні культури
  • Аналіз ліпідів
  • qPCR
  • Детальніше
  • Коментарі

предметів

реферат

У вищих рослин жирні кислоти (ФК) з 18 атомами вуглецю (18 ° С) становлять близько 70% від загальної кількості ФА, найбільш поширеними є 18: 2 та 18: 3. Ці два поліненасичені ФА (ПНЖК) становлять близько 55% суспензій клітин арабідопсису, тоді як 18: 1 становить близько 10%. Рівень ПНЖК може змінюватися залежно від погано визначених факторів. Тут ми порівняли різні набори рослинних клітинних культур і виявили кореляцію між швидкістю росту клітинної популяції та рівнем ненасиченості FA 18C. Ці спостереження дозволяють припустити, що кінцевий рівень ПНЖК може частково залежати від швидкості поділу клітин і що десатурази FAD2 та FAD3, які відповідають за утворення 18: 2 та 18: 3 на фосфоліпідах, мають швидко обмежувальну діяльність. - вирощування культур. У культурі рослинних клітин, як відомо, депривація фосфатів (Пі) порушує ділення клітин і викликає ремоделювання ліпідів. Ми виявили, що голодування Pi не впливало на експресію гена FAD і що рівні PUFA у цій ситуації також корелювали зі швидкістю росту. Таким чином, рівні PUFA, здається, є ознакою у визначенні зрілості та старіння клітин.

Гліцероліпіди є основними компонентами мембранної архітектури. Ці ацилові ліпіди є діефіром жирних кислот (FA) та гліцерином, і групи FA можуть бути як насиченими, так і ненасиченими. У вищих рослин основними видами ФА є 16 ° С і 18 ° С, що становить близько 30 і 70% від загальної кількості ФА 1. Ці ФА присутні з різним рівнем насичення, як правило, не виявляючи (16: 0, 18: 0) трьох (16: 3, 18: 3) подвійних зв’язків для основних видів. Найбільш поширеними типами ФА є 18: 2 та 18: 3, що становить близько 80% від 18 ° C і майже 55% від загальної кількості ФА у культуральних суспензійних клітинах Arabidopsis, тоді як 18: 1 становить близько 10% від загальної ФА 1 .

Ненасичені жирні кислоти відіграють ключову роль у структурі та функції мембрани. Ступінь насичення впливає не тільки на фізико-хімічні властивості ФА, такі як температура плавлення або в'язкість 12, але і на молекулярну форму ліпіду, до якого він приєднаний 13. Це в свою чергу впливає на поведінку ліпідів мембрани та двошарової упаковки. Наприклад, насичені фосфатидилетаноламіни (PE) утворюють пластинчасту фазу, тоді як ненасичені PE утворюють гексагональну HII (інвертовану непластинчасту) фазу 14, 15. Як результат, ферменти, що беруть участь у утворенні ненасичених жирних кислот, відіграють важливу роль у формуванні, функціонуванні та цілісності мембран.

На додаток до цих відомих впливів на навколишнє середовище на рівні ненасиченості ФА, інші невизначені фактори можуть змінювати рівень ПНЖК. Це очевидно в культурах суспензій клітин, де ступінь PUFA може варіюватися в залежності від культури, що іноді ускладнює порівняння результатів. З метою кращого розуміння того, що спричиняє такі варіації, ми виміряли вплив швидкості росту на розподіл ПНЖК у наших моделях рослин. Використовуючи культури суспензій клітин, що містять переважно фосфоліпіди, ми спостерігали кореляцію між швидкістю росту та рівнем ненасиченості FA 18C, припускаючи, що десатурази FAD2 та FAD3 можуть мати обмежувальну активність у культурах, що швидко ростуть, і що кінцевий рівень ненасиченості також може залежати. про швидкість розподілу популяції рослинних клітин.

результат

Для вивчення метаболізму ліпідів у вищих рослинах використовували три моделі клітинних суспензійних культур: стовбурові клітини Acer pseudoplatanus (Sycamore), клітини меристемних клітин листя Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) та культури калюсних клітин арабідопсису. У цих культурах мембранні ліпіди - це переважно фосфоліпіди (від 80 до 90%) із лише невеликою кількістю галактоліпідів (від 10 до 20%) 23. Насправді ці клітини ростуть або гетеротрофно (клітини явора, клітини Arabidopsis calli), або міксотрофно (клітини Arabidopsis calli) і виявляють лише амілопласти (клітини Sycamore та Arabidopsis calli) або слабо розвинені мембрани тилакоїдів з низьким вмістом хлорофілу (клітини Arabidopsis). Це свідчить про те, що PUFA в наших моделях рослин в основному генеруються системою FAD2/FAD3 в ER, з невеликою, але значною перевагою пари FAD6/FAD7 у пластидах. Цей склад дуже різниться у листках, де галактоліпіди становлять понад 60% гліцероліпідів 24, припускаючи, що FAD2 та FAD3 можуть не бути основними постачальниками ПНЖК у цих тканинах.

( A ) репрезентативний експеримент, що показує свіжу вагу та розвиток ліпідів після перенесення клітин у свіже середовище. На 7 день аликвоту суспензії клітин переносили у свіже свіже середовище для нового циклу росту. Щодня брали аліквоту для аналізу жирних кислот. ( B ) основний розподіл FA у клітинах явора, культивованих, як описано в (А).

Повнорозмірне зображення

Через 8 днів росту вимірювали свіжу вагу та розподіл жирних кислот. Початкова свіжа вага становила 1,5 ± 0,2 г для кожної культури. ( A ) кореляційна крива між співвідношенням 18: 1 і масою свіжої ваги Arabidopsis calli. ( B ) кореляційна крива між співвідношенням PUFA (18: 2 + 18: 3) та масою свіжої капусти Arabidopsis. Коефіцієнти кореляції R2 розраховували лінійною регресією за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism. ( C. ) загальний FA у культурах, вирощених або в присутності, або у відсутності Pi. ( D ) розподіл основних полярних гліцероліпідів (MGDG та DGDG для основних галактоліпідів; PC та PE для основних фосфоліпідів) та нейтральних ліпідів (DAG та TAG) у культурах, вирощуваних або в присутності, або у відсутності Pi. ( Е ) Співвідношення 18: 1 та PUFA у великих гліцероліпідах (MGDG, DGDG, PC та PE) та нейтральних ліпідах (DAG та TAG) із культур, вирощених або у присутності, або у відсутності Pi. Дані є середніми значеннями ± SD трьох біологічних повторень для кожного стану. Статистично значущі відмінності (P

Детальний розподіл FA PC та DGDG у калюсах Arabidopsis, вирощених з (+ Pi) або без (-Pi) фосфату ( A ) або в культурах суспензій клітин арабідопсису, які демонструють швидкі або повільні темпи зростання ( B ). Дані є середніми значеннями ± SD трьох біологічних повторень для кожного стану. Статистично значущі відмінності (P

( A ) 18: 1 і розподіл PUFA (18: 2 + 18: 3) у клітинах, культивованих протягом 80 годин у контрольному середовищі або в середовищі без Pi. ( B ) qPCR визначення рівнів експресії FAD у клітинах, вирощених протягом 80 годин, або в контрольному середовищі, або в середовищі, що не містить пі. Результати виражаються у вигляді кратних змін у порівнянні з вихідними умовами контролю. Дані є середніми значеннями ± SD трьох біологічних повторень для кожного стану. Однак статистично значущі відмінності (Р 11. Швидкість синтезу ліпідів у сої є повільним порівняно з іншими олійними рослинами 11, і ситуація може відрізнятися у інших рослин. При розгляді цілої рослини ситуація може також відрізнятися від однієї тканини до іншої, залежно від поділу У культурах клітин, які аналізувались тут, кількість 18: 1 зменшувалась із зменшенням швидкості поділу (див. рис. 1), що вказує на те, що діяльність FAD у цьому стані не була або обмежувала.

Ці результати також свідчать про те, що рівень ненасиченості може варіюватися в залежності від культури, причому ці варіації обумовлені невеликими різницями в темпах зростання. Таким чином, будь-яке лікування, яке впливає на швидкість росту або поділу клітин, може вплинути на рівень ненасиченості, якщо воно не впливає на швидкість синтезу ліпідів та/або експресію або регуляцію FAD. У вищих рослин, обмежених до Пі, ріст і виробництво ФА сильно знижується 23. Обмеження pi не впливало на експресію генів FAD2, FAD3, FAD6 та FAD7, а розраховані коефіцієнти кореляції між рівнем глобальної ненасиченості та швидкістю росту були подібні до тих, що були отримані в умовах помірного помірного росту (порівняно з малюнками 2 та 3 ). Таким чином, це дослідження припускає, що десатурація ліпідів FAD2 та FAD3 у швидко розділяючих системах може не досягти стійкого стану і може зазнавати змін, що визначаються швидкістю росту. Тому кореляція in vivo між діяльністю FAD2/FAD3 та швидкістю проліферації клітин також визначає рівень ПНЖК як характерну особливість зрілості та старіння клітин у рослин.

( A ) кореляційна крива між 18: 2 та свіжою масою шламу, вирощеного в рідкому середовищі з або без Пі. ( B ) те саме, що і А, але для 18: 3. Початкова свіжа маса становила 1,5 ± 0,2 г для кожної культури, а розвиток біомаси вимірювали через 8 днів зростання. ( C. ) кореляційна крива між 18: 2 та свіжою масою культур суспензій клітин. ( D ) те саме, що і С, але для 18: 3. Біомасу вимірювали через 3 дні посіву, а початкова свіжа маса на початку експерименту становила 30 ± 5 мг/мл. Коефіцієнти кореляції R2 розраховували лінійною регресією за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism.

Повнорозмірне зображення

методи

Клітинні культури

Клітини псевдоплатину Acer вирощували у вигляді суспензійних культур у середовищі, як визначено раніше32. Клітини витримували у вигляді 250 мл культури на вертикальному роторному шейкері (125 об/хв) при 22 ° C. Клітини піддавали культивуванню кожні 7 днів, як описано вище. У кожен момент часу збирали близько 0,4 г клітин, фільтрували для видалення середовища, зважували та заморожували в рідкому азоті для аналізу ліпідів.

Клітини Arabidopsis thaliana (екотип Колумбії) вирощували у вигляді суспензійних культур (200 мл) у середовищі Мурасіге та Скуга (MSP09-50LT, Caisson Laboratories, Inc, USA) без фосфатів (Pi) та додавали 1,5% (мас./Мас.). v) сахароза, 1,2 мг л-1 2, 4-дихлорфеноксиуксусна кислота, моногідрофосфат калію 50 мг л-1 та двоосновний фосфат калію 39 мг л-1. Культури витримували при постійному освітленні (100 мкЕ м-2 с -1) при 22 ° C і струшували обертальним струшуванням при 125 об/хв. Клітини пересівали кожні 7 днів з початковою щільністю клітин 30 мг мл-1. У кожен момент часу збирали близько 0,5 г клітин, фільтрували для видалення середовища, зважували та заморожували в рідкому азоті для аналізу ліпідів.

Calli Arabidopsis thaliana (екотип Колумбії) отриманий з мезофільної тканини двотижневих листків розетки Arabidopsis і вирощений на агарових пластинах, що містять середовище Murashige і Skoog (MSP09-50LT, Caisson Laboratories, Inc, USA), доповнений 3% (мас./об.).) сахарози, 1,2 мг L-1 2, 4-дихлорфеноксіоцтової кислоти, моногідрофосфату калію 50 мг l-1 та двоосновного фосфату калію 39 мг l-1. Для кожного експерименту близько 1,5 г осаду видаляли з агарової пластини і суспендували в рідкому середовищі Murashige і Skoog з або без Пі (Caisson Laboratories, Inc, USA) з додаванням 1,5% (мас./Об.) Сахарози та 1,2 мг . 1-1 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота. У кожний момент часу з суспензійних культур калюсу відбирали аликвоти, фільтрували для видалення середовища, а шлам зважували та заморожували в рідкому азоті для аналізу ліпідів.

Аналіз ліпідів

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Meï, C. et al. Рівні поліненасичених жирних кислот корелюють із швидкістю росту в культурах рослинних клітин. Наук. Респ. 5, 15207; doi: 10, 1038/srep15207 (2015).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов надання послуг та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте щось образливим або не відповідаєте нашим умовам чи інструкціям, позначте це як невідповідне.