предметів
реферат
Суб'єкти з ожирінням мають високий рівень глюкагону натще 1, 2 на додаток до підвищених концентрацій циркулюючого інсуліну 1. Незважаючи на те, що велика увага приділяється підвищеному рівню інсуліну, який прискорює розвиток цукрового діабету 2 типу (T2DM) 3, високий рівень глюкагону натще приділяв все більшу увагу, як не менш важливий для прогресування захворювання до T2DM 4. За звичайних обставин підвищення рівня глюкози має протилежні наслідки для секреції інсуліну та глюкагону з бета- та альфа-клітин, що є парадоксальним для пацієнтів з T2DM, коли підвищення рівня глюкози стимулює обидва гормони 5. Підвищений рівень глюкагону викликає вироблення печінкової глюкози, що призводить до вищої потреби в інсуліні, що може прискорити стрес бета-клітин і, таким чином, сприяти розвитку захворювання6.
Секреція глюкагону та інсуліну натще може регулюватися паракринними ефектами, наприклад Інгібуюча дія інсуліну на альфа-клітини 20, 21, 22 та соматостатину на альфа- та бета-клітини 23, 24. На основі цих спостережень зниження секреції соматостатину може сприяти збільшенню секреції як глюкагону, так і секреції інсуліну. Ступінь, в якій спостерігається таке зменшення вивільнення соматостатину в умовах голодування, коли секреція глюкагону та інсуліну зростає, невідома.
Враховуючи ситуацію у дітей із ожирінням із супутніми підвищеннями інсуліну та глюкагону 1 та підвищеними рівнями FFA при нормальному рівні глюкози натще 25, наша мета полягала у дослідженні того, як хронічно підвищені рівні FFA впливали на секрецію глюкагону, інсуліну, а також соматостатину з виділених острівців людини натщесерце. держава. концентрації глюкози з особливим акцентом на роль FFAR1.
результат
Пальмітат збільшує секрецію базальтових острівців глюкагону та секрецію інсуліну через FFAR1
Вплив пальмітату на накопичений глюкагон (панель A) та секрецію інсуліну (панель B) з ізольованих людських острівців, культивованих протягом 0,25 - 7 днів при 5,6 мМ глюкози у відсутності (білі символи) або присутності (чорні символи) пальмітату з і без FFAR1 антагоніст ANT203. Клітинний вміст глюкагону (панель С) та інсуліну (панель D) в кінці культури на острівцях, оброблених пальмітатом з антагоністами FFAR1 та без них ANT203 та ANT825, був представлений як% вмісту гормону в острівцях, які отримували контрольне лікування. Рівні мРНК FFAR1 (панель E) та білка (панель F) в острівцях, оброблених пальмітатом, без антагоніста FFAR1 ANT203. Рівні транскрипту та білка виражаються як% рівнів на острівцях, які отримували контрольне лікування. Результати показують середнє значення ± SEM n = 3-5 експериментів з експериментів донорів. * P # p
Вплив зменшення експресії FFAR1 на накопичену секрецію гормону з людських острівців, культивованих на 5,6 мМ глюкози за відсутності (білі смужки) або присутності 0,5 мМ пальмітату (чорні смуги) протягом 1 дня. Відносний рівень іРНК FFAR1 (панель A) та загального білка FFAR1 (панель B) в кінці культури порівняно з цільовою shRNA не ссавців (neg) або лікуванням shPHK, націленою на shfar (Ffar1). Показані накопичені секрети глюкагону (панель С), інсуліну (панель D) та соматостатину (панель Е). Результати показують середнє значення ± SEM і беруться з n = 3-5 експериментів донорів. * P # p
Вплив FFAR1 та бета-окислення жирних кислот на базальний глюкагон (панелі A, G), інсулін (панелі B, H) та секрецію соматостатину (панелі C, I) та вміст (панелі DF, F). Людські острівці культивували протягом 1 дня з агоністами FFAR1 або без них; TAK-875, GW9508, TUG-499 порівняно з пальмітатом (чорні смуги) (панель A - C) та пальмітатом з ANT825 та без нього та/або етомоксиром (панель G - I). Результати показують середнє значення ± SEM і беруться з n = 5 експериментів донорів. # Р 16, 26. Коли наші результати цього дослідження показали, що на секрецію острівцевих гормонів впливає пальмітат через FFAR1 при базальній концентрації глюкози, ми припустили, що жирна кислота може також впливати на дихання при концентрації глюкози натще. Насправді дихання мітохондрій було зменшено або гострим додаванням ANT203 до острівців, що зазнали впливу 5,6 мМ глюкози та пальмітату (рис. 4А, В), або включенням структурно іншого антагоніста ANT825 під час культури острівців у присутності 5,6 мМ глюкози та пальмітат (рис. 4C, D). Зменшення дихання мітохондрій ANT825 у присутності пальмітату в основному було зумовлене зменшенням дихання, асоційованого з АТФ (рис. 4Е).
Роль FFAR1 та бета-окислення жирних кислот у впливі пальмітату на секрецію та дихання інсуліну EndoC-pH1. Клітини піддавали дії 5,6 мМ глюкози у відсутність (білі символи) або присутність (чорні символи) пальмітату з ANT825 та/або етомоксиром, триметазидином та без нього. Секреція інсуліну (панель А). Репрезентативні кінетичні записи OCR з клітин, гостро підданих дії пальмітату за допомогою ANT825 та/або етомоксиру (панель B). Мітохондріальний OCR (панель C), пов'язаний з ATP OCR (панель D) та OCR для виходу з протону (панель E). Результати показують середнє значення ± SEM (панелі A, CE,) (n = 5) та середнє значення ± SD (панель B) (N = 6). * P # P & P 1, 2. У цьому дослідженні ми наводимо докази того, що таке подвійне острівцеве гормональне посилення може бути результатом підвищених концентрацій циркулюючої жирної кислоти, що характерно для цієї групи пацієнтів 25. Таким чином, рівень глюкагону та інсуліну натще може бути зумовлений поєднанням активації FFAR1 та метаболізму острівцевих клітин, а не просто компенсацією інсулінорезистентності. Розуміння механізмів, за допомогою яких FFA викликають посилену базальну секрецію острівцевих гормонів, має вирішальне значення для зупинки цього порочного кола.
Результати цього дослідження отримані з експериментів in vitro і не можуть бути безпосередньо перенесені в обстановку in vivo зі складністю, включаючи, наприклад, інкретини, нейрональну активність та різні FFA, які модулюють секрецію інсуліну та глюкагону. Однак результати показують механізм, за допомогою якого підвищена циркуляція FFA та тригліцеридів може призвести до супутнього підвищення тонусу базальної секреції глюкагону та секреції інсуліну натще, що може погіршити контроль глюкози в хронічній ситуації.
Підводячи підсумок, ми робимо висновок, що FFA є регуляторами секреції не тільки інсуліну, але також глюкагону та соматостатину при концентрації глюкози натощак з людських острівців, і що FFAR1 є ключовим у цьому питанні. Тобто, вплив FFAR1 на секрецію гормону не обмежується посиленням при підвищених концентраціях глюкози, як обговорювалося раніше, а скоріше залежить від паливного субстрату. Тому ми припускаємо, що ендогенні ліганди FFAR1 можуть посилювати вивільнення інсуліну та глюкагону при концентрації глюкози натще через їх подвійну роль як активаторів рецепторів та метаболітів палива.
Матеріали і методи
Острівці підшлункової залози людини
Людські острівці були отримані від мертвих, в іншому випадку здорових людей без відомих метаболічних захворювань, в Уппсальському відділі трансплантації острівців та Prodo Lab Inc. (Ірвін, Каліфорнія, США). Етичне дозвіл на використання та процедури та протоколи поводження з острівцями, ізольованими від фізичних осіб, було отримано від Регіональної комісії з оцінки етики в Упсалі, Швеція (номер EPN 2010/006; 2010-02-10). Усі процедури, що стосуються острівців, виконувались відповідно до вищезазначеного дозволу, а також відповідно до чинних місцевих директив та норм. Письмова інформована згода всіх донорів була надана та задокументована окремими донорами або членами їх сімей. Отримання та документування письмової згоди на пожертвування на острівці для досліджень було здійснено відповідно до вищезазначеного схвалення Регіональної комісії з огляду етики в Упсалі, Швеція, а також відповідно до чинних місцевих норм та правил. Загалом використовували острівці від 19 донорів, що не страждають на діабет. Острівці культивували в середовищі CMRL 1066, що містить 5,6 мМ глюкози, і доповнювали 10% FBS (Invitrogen, Пейслі, Великобританія), надалі називаними умовами контролю. Експерименти розпочали через 3 - 7 днів після ізоляції.
Клітини EndoC-pH1
Клітини EndoC-pH1 27 вирощували на 1% гелі позаклітинної матриці та на 2 мкг/мл покритих фібронектином посуді для культури в DMEM, що містить 5,6 мМ глюкози, 2% фракції альбуміну бичачої сироватки без жирних кислот (BSA) (Roche Diagnostics, Mannheim, Німеччина).). ), 10 мМ нікотинаміду, 50 мкМ 2-меркаптоетанолу, 5,5 мкг/мл трансферину, 6,7 нг/мл селеніту натрію, 100 од/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину. Якщо не вказано інше, всі хімічні речовини були отримані від Sigma Aldrich.
Обробка острівців та клітин ендоС-pH1 довголанцюговим пальмітатом жирних кислот
Вимірювання гормональної секреції та вмісту
Концентрації глюкагону, інсуліну (Mercodia AB, Уппсала, Швеція) та соматостатину (Peninsula Laboratories, Сан-Карлос, Каліфорнія, США) у культуральному середовищі та у зразках клітинного лізату вимірювали методом ІФА. Вміст гормону нормалізували до загального вмісту білка, виміряного аналізом білка постійного струму (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США), а потім представили як багаторазове контрольне лікування.
Зниження регуляції шРНК FFAR1
Коротка шпилька РНК (узагальнена) від FFAR1 була використана для інгібування експресії FFAR1 і їй вводили SHCLNV VSV-G Перенос часток вірусів (місія передачі частинок, Sigma Aldrich), яка містить підсумкове націлювання Ffar1/Gpr40 із послідовністю CCGGCGCCTCGGTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTT Приблизно 50 острівців було трансдуковано в кожну лунку (96-лункова платівка без культури тканин) з трансдукційними частинками 2-5 x 10 6 TU в 50 мкл суміші DMEM 1: 1, змішаної з культуральним середовищем CMRL (без FBS без BSA) для 2 години, як було описано вище. Потім додавали ще 150 мкл живильного середовища і давали суміші інкубувати протягом 22 годин. Згодом середовище замінили 200 мкл середовища CMRL. На підставі оціночного лікування оборотом рецепторів, через 3 дні після початку трансфекції та зразки, відібрані через 2 дні після початку лікування пальмітатом, були розпочаті.
Вимірювання рівня мРНК FFAR1 методом ПЛР у режимі реального часу
Загальну мРНК виділяли з острівцевих клітин із використанням РНК NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Duren, Німеччина) та реверсували транскрипцію в кДНК за допомогою системи синтезу першого ланцюга SuperScript-III для RT-qPCR (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). ПЛР у режимі реального часу проводили в обсязі 10 мкл, використовуючи комплект Dynamo Capillary SYBR Green qPCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Для ампліфікації використовувались такі праймери: FFAR1 (прямий праймер, 5'-ATCACAGCCTTCTGCTAC і зворотний праймер, 5'-CCTAGATTGGGGTACAGG), β-актин (прямий праймер, 5'-ACGTGGACATCCGCAAAGAC) і (зворотний праймер, 5T-CCTTTGCT Рівень мРНК FFAR1 нормалізували до еталонного гена β-актину, використовуючи наступну формулу: цільова кількість = 2-AACt, де AACt = [Ct (GPR40 KO) - Ct (β-актин KO)] - [Ct (контроль GPR40) - Ct (контроль β-актину)] 55 .
Вимірювання рівня білка FFAR1 методом ІФА
Приблизно 100-500 ізольованих людських острівців збирали після культивування та тричі промивали крижаним PBS. Клітини лізували в 100 мкл 1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) у PBS. Лізати пройшли п’ять циклів швидкого заморожування та розморожування, щоб збільшити кількість зв’язаних з мембраною білків. Загальний FFAR1 у зразках лізату вимірювали комерційним людським FFAR1/GPR40 Sandwich ELISA (LS-F8454, LifeSpan BioSciences, WA, США) відповідно до інструкцій виробника. Клітини HEK293 використовували як негативний контроль і демонстрували низьку реакційну здатність у відповідь у порівнянні з клітинами EndoC-pH1 (див. Додатковий малюнок SI).
Клітинне дихання
Мітохондріальне дихання ізольованих острівців людини та клітин EndoC-pH1 визначали за допомогою вимірювань OCR в аналізаторі позаклітинного потоку XF96e (Agilent Technologies). Аналізи проводили в мінімальному середовищі для аналізу XF (Agilent Technologies), доведеному до рН 7,4 і доповненому 5,6 мМ глюкози. Обидва острівці (10-30 на лунку і 10 лунок для кожного стану (N = 10)) та клітини EndoC-pH1 поміщали в 96-лункову лунку (60000 клітин на лунку та принаймні 6 лунок для кожного стану (N = 6 ).)) попередньо покриті (див. вище) культуральні пластини. Мітохондріальну функцію визначали шляхом вимірювання базального дихання, АТФ-асоційованого дихання, втечі протонів, максимальної дихальної ємності шляхом додавання інгібіторів олігоміцинового транспортного ланцюга (2 мкМ), ротенону (5 мкМ) та антиміцину (5 мкМ), іонофор. FCCP (2 мкМ), як описано вище 16. Базальний OCR вимірювали через 2 години культури. Всі вимірювання OCR були скориговані на немітохондріальний OCR. Якщо не вказано інше, всі хімічні речовини були отримані від Sigma Aldrich.
Статистичний аналіз
Аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Graph Pad Prism, версія 6 (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Для статистичного аналізу використовували парні t-тести та одноразові вимірювання однобічного ANOVA (з пост-хок-тестом Fisher LSD). P