захищає

  • реферат
  • Головний
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • Лікування тварин
  • Індукція ІГС
  • Заміна лептину
  • Вимірювання аланінамінотрансферази
  • гістологія
  • ТУНЕЛЬ забарвлення
  • Олійно-червоний барвник O
  • Аналіз цитокінів плазми
  • Вилучення РНК та зворотна транскрипція
  • ПЛР у режимі реального часу
  • Імуноблот-аналіз
  • Визначення електрофоретичної рухливості
  • Статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Лікування ConA збільшує накопичення жиру в печінці
  • Дефіцит SCD1 захищає мишей від ІГС
  • Дефіцит SCD1 пригнічує запальні молекули в патогенезі ІГШ
  • Дефіцит SCD1 пригнічує шляхи транскрипції NF-kB B та STAT1
  • Зниження рівня лептину опосередковує стійкість до ІГС у мишей з дефіцитом SCD1
  • ОБГОВОРЕННЯ

реферат

Імунітет і обмін речовин тісно пов’язані. Печінка є важливим метаболічним органом в організмі. Однак взаємодія між гепатоцитами та імунною системою недостатньо вивчена. У мишей, у яких розвинувся гепатит, індукований конканаваліном A (ConA) (CIH), ми виявили значне накопичення ліпідів у гепатоцитах. Критично важливий фермент, який бере участь у синтезі жиру, такий як стеароїл-КоА десатураза 1 (SCD1), регулюється. Коли ми вводили ConA мишам з дефіцитом SCD1, ми виявили, що ці миші були високо стійкими до CIH. Механізми захисного ефекту дефіциту SCD1 можна пояснити зниженням рівня лептину у тих мишей, які модулювали критичні цитокіни та сигнальні шляхи в патогенезі ІГС. На закінчення наше дослідження показує, що дефіцит SCD1 захищає мишей від лептинозалежного пошкодження печінки.

Головний

Накопичені дані свідчать про те, що імунний та енергетичний обмін тісно пов’язані. Голодування та недоїдання можуть придушити імунні реакції та підвищити сприйнятливість до інфекцій, тоді як ожиріння пов’язане зі станом аберрантної імунної активності та підвищеним ризиком запальних захворювань. 1 Печінка є найбільшим і найважливішим метаболічним органом в організмі. Він переробляє основні категорії поживних речовин після їх всмоктування з травного тракту і зберігає глікоген, жири та вітаміни. В останні роки роль печінки як головного імунного органу дедалі більше визнається. 2

Імунні клітини, включаючи клітини Купфера і лімфоцити, складають приблизно 45% від загальної кількості негепатоцитарних клітин нормальної печінки. 3 Ці клітини відіграють вирішальну роль у захисті імунної системи від вторгнення патогенів. Миші з печінковим стеатозом з високим вмістом жиру демонструють знижену частку природних Т-клітин-кілерів (клітин NKT) у печінці та сприйнятливі до пошкодження печінки, спричиненого ліпополісахаридами (LPS). 4, 5 Крім того, у гепатостеатотичних мишей, у яких розвивається гепатит, індукований конканаваліном A (ConA) (CIH), диференціація Т-клітин значно зміщується у напрямку до профілю Th1. Крім того, у гепатостеатотичних мишей спостерігались важкі ураження печінки та висока продукція прозапальних цитокінів, включаючи фактор некрозу пухлини α (TNF-α) та інтерферон-γ (IFN-γ). Тому метаболічні синдроми пропонуються як фактори ризику імунно-опосередкованого запалення та ураження печінки. Однак спосіб впливу запалення на ліпідний обмін у печінці та взаємодію між імунними клітинами та гепатоцитами досі недостатньо вивчений.

У нашому дослідженні ІГС у мишей ми спостерігали значне накопичення ліпідів у гепатоцитах. Критично важливий фермент, що бере участь у синтезі жиру, стеароїл-КоА десатураза 1 (SCD1), суттєво регулюється. Намагаючись індукувати CIH у мишей з дефіцитом SCD1, ми виявили, що ці миші були високо стійкими до CIH. Потім були з’ясовані механізми, що призводять до стійкості до ІГС у мишей з дефіцитом SCD1. Наші результати додають подальших прямих доказів того, що гепатостеатоз суттєво впливає на імунні реакції в печінці. Тому ми пропонуємо додатково дослідити модуляцію жирового обміну як потенційну стратегію втручання та лікування запальних захворювань печінки.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Лікування тварин

Самців мишей C57BL/6 у віці від 8 до 10 тижнів було придбано у Shanghai SLAC Laboratory Animal CO LTD (Шанхай, Китай). Миші Ab Xyk (схрещені до мишей Balb/c, покоління F2) зі спонтанною дисфункцією SCD1 були описані раніше. 7 Мишей утримували у тваринницьких закладах Шанхайського інституту біологічних наук Китайської академії наук у вільних від патогенів умовах відповідно до керівних принципів Комітету з питань інституційного догляду та використання тварин. Мишей годували ad libitum стандартною лабораторною дієтою на корм для тварин, наданою SLAC Laboratory Animal CO LTD.

Індукція ІГС

Мишам вводили одну вену (15 мг/кг маси тіла) хвостової вени ConA, щоб створити модель CIH.

Заміна лептину

Миші Ab Xyk/ab Xyk отримували 1 мг/кг рекомбінантного лептину миші (R&D Systems, MN, USA) або PBS шляхом інтраперитонеального введення двічі на день протягом 5 днів. Згодом ConA вводили всім мишам.

Вимірювання аланінамінотрансферази

Плазму отримували приблизно через 17 годин після ін’єкції ConA. Рівні аланінамінотрансферази (ALT) визначали за допомогою набору для виявлення ALT (Shanghai Yihua Medical Science & Technology, Шанхай, Китай) відповідно до інструкцій виробника.

гістологія

Печінку видаляли після перфузії PBS, фіксували 4% фосфатним буферним параформальдегідом і вбудовували в парафін. Зрізи тканин (5 мкм) готували, фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) та досліджували за допомогою світлової мікроскопії. Для кожної тварини було проаналізовано 10 зрізів тканини.

ТУНЕЛЬ забарвлення

Фрагментацію ДНК аналізували в тканинах печінки, вкладених у парафін, за допомогою кінцевої реакції мічення dUTP-біотину нікелем кінцевого дезоксинуклеотидилтрансферази (TUNEL) відповідно до інструкцій виробника (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). Потім зрізи досліджували за допомогою світлової мікроскопії. Для кожної тварини було проаналізовано 10 зрізів тканини.

Олійно-червоний барвник O

Заморожені зрізи печінки (8 мкм) фарбували Oil Red O (Sigma, MO, США) протягом 10 хвилин, а потім фарбували гематоксиліном протягом 45 с. Потім зрізи досліджували за допомогою світлової мікроскопії. Для кожної тварини було проаналізовано 10 зрізів тканини.

Аналіз цитокінів плазми

Концентрації TNF-α, IFN-γ та лептину у плазмі крові визначали за допомогою специфічних наборів для імуноферментного аналізу (R&D Systems) відповідно до інструкцій виробника.

Вилучення РНК та зворотна транскрипція

Загальну РНК виділяли з гранул клітин та тканин печінки за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Геномну ДНК видаляли із загальної РНК перед синтезом кДНК за допомогою набору без ДНКази ДНКази для розщеплення ДНКази під час очищення РНК (Qiagen). РНК зберігали при -80 ° C. Синтез кДНК першої ланцюга проводили для кожного зразка РНК із використанням набору Sensiscript RT (Qiagen). Для приготування синтезу кДНК використовували випадкові гексамери.

ПЛР у режимі реального часу

Виконано експресію генів індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS), індукованого інтерфероном білка 10 (IP-10), хемотаксичного білка моноцитів-1 (MCP-1), запального білка макрофагів-1a (MIP-1a), мРНК SCD1 та лептину методом ПЛР в режимі реального часу з використанням основної суміші SYBR Green (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Умови термоциклеру включали початковий період витримки при 50 ° C протягом 2 хвилин, потім при 95 ° C протягом 10 хвилин. Далі послідувала двоступенева програма ПЛР, що складається з 95 ° С протягом 15 с і 60 ° С протягом 60 с протягом 40 циклів. Дані збирали та кількісно аналізували за допомогою системи виявлення послідовностей ABI Prism 7900 (Applied Biosystems). Β-актин використовували як ендогенний контроль для нормалізації відмінностей у кількості загальної РНК у кожній пробі. Всі суми виражали кратними щодо експресії β-актину. β-актин:

Імуноблот-аналіз

Імуноблот-аналіз проводили з використанням зразків цільних екстрактів клітин печінки, розділених електрофорезом на 10% SDS-поліакриламідному гелі і перенесених на мембрану PVDF. STAT1, фосфо-STAT1 (Thr-701), STAT3 та фосфо-STAT3 (Tyr-705) були візуалізовані за допомогою антитіла від BD Bioscience (Каліфорнія, США).

Визначення електрофоретичної рухливості

Екстракти печінки з тканин печінки готували, як описано вище. 8-ланцюговий одноцепочечний олігонуклеотид, що зв'язує NF-κB (5'-AGTTAGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 '), вперше був гібридизований з олігонуклеотидом комплементу (5'-GCCTGGGAAAGTCCCTCAACT-3'). Відпалений фрагмент ДНК мітили [γ-32 P] dATP (Amersham, Piscataway, NJ, USA) із застосуванням полінуклеотидної кінази Т4 (Promega, Madison, WI, USA). Ядерні білки (15 мкг) інкубували з 2,5-міченими ng32P дволанцюговими олігонуклеотидними зондами протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Суміш відокремлювали електрофорезом на 4% поліакриламідних гелях з 0,5 х трис-борат-етилендіамінтетрауксусной кислотою при 4 ° С.

Статистичний аналіз

Усі результати були виражені як середнє значення ± sd. Статистичне порівняння між двома групами проводили за допомогою t-критерію Стьюдента після дисперсійного аналізу. Рівень значущості був встановлений на рівні = 0,05. Усі тести були двосторонніми.

РЕЗУЛЬТАТИ

Лікування ConA збільшує накопичення жиру в печінці

CIH - широко застосовувана тваринна модель імунно-опосередкованого ураження печінки і може бути індукована внутрішньовенним введенням ConA мишам. Ми виявили, що накопичення жиру в гепатоцитах спостерігалося вже через 2 години після ін’єкції ConA, як це показує фарбування Олійно-червоним О (рис. 1а). Тим часом регулювався критичний фермент, який бере участь у синтезі жиру, SCD1 (Рисунок 1b). Ми також виявили, що інші ключові ліпогенні гени, включаючи синтазу жирних кислот, ацетил-КоА карбоксилазу 1 та Елов16, демонстрували подібну картину експресії до SCD1 (рис. 1b). Таким чином, на початковій фазі індукції ІГС, спільно з розвитком імунореакцій, що пошкоджують тканини, відбувся посилений синтез і накопичення жиру.

Накопичення ліпідів при ХІГ. Чотири групи мишей C57BL/6 (n = 5) отримали ін'єкцію ConA (15 мг/кг) через хвостову вену. a ) Показані репрезентативні мікрофотографії, що демонструють фарбування зрізів печінки олійним червоним. Збільшення жиру (червоного) в гепатоцитах через 2 - 24 години після ін’єкції ConA порівняно із спокоєм (0 год). ( b ) Експресія SCD1, FAS, ACC1 та Elov16 у мРНК печінки. Результати повідомляються як середнє значення ± sd. Дані репрезентативні для п’яти експериментів.

Повнорозмірне зображення

Дефіцит SCD1 захищає мишей від ІГС

SCD1 відіграє ключову роль у ліпідному обміні. 9, 10 миші з дефіцитом SCD1 демонструють дефектний синтез холестерину та тригліцеридів у печінці, 11, 12, таким чином демонструючи знижений стеатоз печінки. Миші Ab Xyk 7 - це нещодавно охарактеризовані миші асбію зі спонтанною дисфункцією мутації гена SCD1. Ми використовували цих мишей для індукування ІГС. Їх посліди з нормальним фенотипом (+/+ або +/ab мишей Xyk, позначені як +/a) використовувались як контрольні.

Через чотири години після індукції ІГС у мишей ab Xyk/ab Xyk спостерігався значно нижчий гепатостеатоз порівняно з + /? миші (рис. 2а). Сироватку збирали через 17 годин після введення ConA для вимірювання АЛТ для перевірки тяжкості ураження печінки. Ми виявили, що рівень АЛТ у сироватці крові різко збільшився після індукції ІГС в +/-? мишей (9183 ± 1629, U/L), що вказує на серйозне пошкодження печінки у цих мишей. Однак у мишей ab Xyk/ab Xyk збільшення рівня АЛТ у сироватці крові, індуковане ConA, було значно заблоковано (88 ± 50, U/L; P спостерігалося лише кілька запальних або некротичних уражень у мишей ab Xyk/ab Xyk (рис. 2в ad). Миші з дефіцитом SCD1 виявилися високо стійкими до ІГС.

Миші з дефіцитом SCD1 стійкі до гепатиту, викликаного ConA. Миші з дефіцитом SCD1 (ab Xyk/ab Xyk) та контрольні миші з посліду (+/a) (n = 5) отримували ін'єкцію ConA (15 мг/кг) через хвостову вену. Масляно-червоне фарбування частин печінки через 4 години після ін'єкції ConA ( a ). Через сімнадцять годин після ін’єкції ConA отримували плазму та вимірювали рівень АЛТ ( b ). Одночасно видаляли печінку та фіксували у 4% параформальдегіді. Виконували H&E фарбування печінки ( c ) і TUNEL ( d ), а результати досліджували за допомогою світлової мікроскопії (збільшення × 200). Результати повідомляються як середнє значення ± sd. Дані є репрезентативними для п’яти експериментів. ** P Xyk/ab Xyk дуже ослаблений (рис. 3а та b). Також була досліджена експресія декількох основних медіаторів запалення, включаючи iNOS, IP-10, MCP-1, MIP-1α, які, як кажуть, мають важливе значення в патогенезі ІГС. Виявлено, що експресія всіх цих медіаторів запалення була значно нижчою у мишей ab Xyk/ab Xyk, ніж у +/a. миші після індукції CIH (рис. 3c-f).

Разом із накопиченням ліпідів ми виявили підвищену експресію SCD1 у печінці мишей CIH. SCD1 - центральний ліпогенний фермент, який перетворює насичені жирні кислоти з довгими ланцюгами в мононенасичені жирні кислоти (MUFA). Потім ми запитали, як CIH буде проявлятися у мишей з дефіцитом SCD1. Як і очікувалось, миші з дефіцитом SCD1 були високорезистентними до СНІ, як показали вимірювання рівня АЛТ у сироватці крові та гістологічне дослідження печінки. Хоча нещодавно опублікований звіт показав, що миші з дефіцитом SCD1 демонструють підвищений ступінь тяжкості на моделі гострого коліту, індукованого декстраном сульфатом натрію. Вплив дефіциту SCD1 на імунно-опосередковані ураження печінки був невідомий. Отримані нами дані дозволяють припустити, що SCD1, ключовий фермент, який бере участь у метаболізмі жирів, бере участь в імунно-опосередкованому ураженні печінки. Потім ми продовжили вивчати основний механізм.

Нам цікаво, як SCD1, фермент для біосинтезу MUFA, може впливати на запалення. Ми відзначили звіт Ntambi та співавт., Що вироблення лептину пригнічувалося у мишей з дефіцитом SCD1 на дієтах та дієтах з високим вмістом жиру. 14 Як відомо, лептин є критично важливим ланкою між енергетичним метаболізмом та імунітетом. Лептин впливає на багато імунні шляхи прямим або непрямим шляхом. Ключові патогенні імунні клітини в ІГШ, такі як Т-клітини та NKT-клітини, можуть активуватися лептином. Лептин також сприяє виробленню прозапальних цитокінів, таких як TNF-α та IFN-γ, які мають вирішальне значення в патогенезі ІГС. 13, 38 Попереднє дослідження показало, що чутливість до CIH може бути підвищена за допомогою лептину, підтримуючи велику кількість печінкових клітин NKT, а також шляхом посередницької активації Т-клітин та вироблення цитокінів. Тому ожиріння та метаболічний синдром піддають печінку підвищеному ризику імунно-опосередкованого пошкодження залежно від лептину механізму. 39 Дефіцит лептину зменшує тяжкість моделі ІГС. Тут ми спостерігали зниження рівня лептину в сироватці крові та експресії мРНК лептину в жировій тканині у мишей з дефіцитом SCD1. Експеримент із заміщенням також підтвердив, що зниження рівня лептину суттєво сприяло захисній ролі дефіциту SCD1 в індукції ІГС.

Деякі відомі регулятори ліпідного обміну, що стимулюють окислення жирів, включаючи метформін та поліненасичені жирні кислоти омега-3, виявляють гепатопротекторну активність проти імунно-опосередкованих пошкоджень печінки. 40, 41 У цьому дослідженні ми чітко продемонстрували, що інактивація SCD1, ключового регулятора ліпідного обміну, захищає мишей від ІГС. Подібні захисні ефекти спостерігалися після попередньої обробки мишей активатором метформіну AMPK (наші неопубліковані дані). Наші висновки дають прямі докази того, що регулювання енергетичного обміну може змінити імунні реакції в печінці. Це свідчить про новий підхід до розуміння та, можливо, контролю перехресних зв’язків між енергетичним метаболізмом та імунною системою в печінці. Такий підхід може допомогти та покращити лікування захворювань печінки в майбутньому.