МікроРНК - це нещодавно виявлений клас природних коротких некодуючих молекул РНК, які негативно регулюють експресію еукаріотичних генів шляхом зв'язування з комплементарними послідовностями в 3'-UTR цільової мРНК. Швидко збираються докази того, що дисфункціональна експресія мікроРНК є загальною рисою гематологічної злоякісності. 1 Однак, за винятком, можливо, хронічного лімфолейкозу (ХЛЛ), роль мікроРНК у гематологічних злоякісних захворюваннях недостатньо відома; Зокрема, аномально експресовані мікроРНК в лімфомі дотепер систематично не ідентифіковані. Для вирішення цієї проблеми ми використовували аналіз мікрочипів, щоб зосередитись на експресії мікроРНК у широкому діапазоні гематологічних клітинних ліній (n = 40), включаючи всі основні типи В- і Т-клітинних лімфом (n = 29), доброякісні лімфопроліферативні розлади, стійкий поліклональний В-клітинний лімфоцитоз (PPBL; n = 3), гострий Т-клітинний лімфобластний лейкоз (T-ALL; n = 6) та гострий мієлоїдний лейкоз (AML; n = 2; таблиця 1). Для порівняння цих зразків з нормальними клітинами-походженнями, а також ролі мікроРНК у розвитку лімфоцитів, ми також дослідили експресію на основних стадіях розвитку В-лімфоцитів та зрілих підгруп Т-клітин (n = 12; Таблиця 1 ). ).

Стіл в натуральну величину

Зразки (приблизно 107 клітин) спочатку очищали до збагачених мікроРНК фракцій за допомогою колонок miREase від Qiagen (Кролі, Великобританія) та 500 нг, мічених Cy3 або Cy5, за допомогою набору Array 900microRNA RT від Genisphere (Hatfield, PA, USA). Мигдаликовий матеріал, зібраний з 12 здорових людей, використовувався як загальний еталонний матеріал для експериментів із використанням збалансованого кольору. Зразки гібридизували з мікрочипами (мікрочипами мікроРНК), які включають повний набір людських і похідних від EBV органів зрілих зондів мікроРНК (MirBase v.9.2), які завантажувались у чотири рази неподалік. Послідовності зондів доступні на сайті www.microRNAworld.com. Чутливість, специфічність та відтворюваність полів перевіряли, як описано (додаткові рисунки S1 - S3). Рівні відібраних мікроРНК вимірювали кількісною RT-PCR (qRT-PCR), як описано вище, використовуючи U6 як контроль.

розвитку

Теплова карта експресії мікроРНК людини в 40 гематологічних клітинних лініях та 12 підгрупах лімфоцитів, виміряних аналізом мікрочипів. Детальна інформація про клітинні лінії наведена в таблиці 1. Неконтрольований кластерний аналіз проводили при низькому нормованому логарифмічному співвідношенні (зразок/еталон) рівнів експресії (в середньому чотири повторення). Розгорнута дендрограма відображається на сторінці термокарти.

Повнорозмірне зображення

Двадцять сім мікроРНК були ідентифіковані як диференційовано експресовані (модифіковані Р * та miR-96) і визначені як високо виражені в клітинних лініях як нормальні зразки лімфоцитів (малюнки 2а-с).

( a ) Рівні експресії мікрочипів мікроРНК диференційовано експресуються (модифікований Р 4 і сильно експресується у зрілих В і Т-клітинах, де він контролює перехід від про-пре-В-клітин. Рамкіссон та співавт. 5 раніше повідомляли, що miR-223 не може бути виявлено блотерном у В-клітинах людини, наші результати та результати Landgraf та співавт.4 виявили, що ця мікроРНК експресується в нормальних лімфоцитах, але не в В- або Т-клітинних лініях, за винятком мієлоїдних клітинних ліній, узгоджених з його роллю в диференціюванні мієлоїдів (рис. 2г). Однак Рамкіссон та співавт. 5 показали експресію miR-223 у В-клітинах, коли замість методу нижчої чутливості застосовували гібридизацію розчину, і миР-155 виявив, що південний аналіз не виявив, В або Т-клітин 5, але згодом виявився важливим регулятором у розвитку цих клітин.6 Порівнюючи профілі експресії В-та Т-клітинних підмножин, було визначено шість мікроРНК як диференційовано виражені (miR-92, miR-342, miR-559, miR -768, miR-146b та miR-125a). були сильніше виражені в Т-клітинах, ніж у В-клітинах (малюнки 3a, d та e).

Рівні експресії мікрорінок мікрочипів різно експресуються (модифікований Р 6 На додаток до miR-155, ми виявили, що активація В-клітин in vitro шляхом стимуляції IL-2 або IgM призвела до змін у експресії одинадцяти мікроРНК, більшість з яких (9/11) були регульованими, включаючи miR- 9. miR-7 та miR-132 (малюнки 2b aca 3b, fg) На відміну від цього, термінальні стадії розвитку В-клітин (пам’ять/плазматичні клітини) були пов’язані зі зниженням регуляції (10/11) диференційовано експресованих мікроРНК, включаючи miR-181a, який аналогічним чином зменшує реакцію на дозрівання Т-клітин (малюнки 3c та 3). Цікаво, що три з цих мікроРНК, miR-17, miR-20b та miR-106a, також були визначені як підвищені в активації В-клітин. Ці мікроРНК також є частиною кластера 17-92, що свідчить про невідому досі функцію цього кластера в диференціації В-клітин.

Хоча профілі мікроРНК клітинних ліній значною мірою відображали діагноз, існує дуже мало кандидатів на мікроРНК, експресія яких була чітко пов'язана з конкретним діагнозом, що припускає, що окремі мікроРНК можуть бути обмежені класифікацією лімфоми. Єдиним винятком був miR-148a, який був сильно виражений у мієломі, але не в інших B- або Т-клітинних лініях або лімфоцитах (малюнки 4c та h). Про miR-148a відомо мало, хоча було встановлено, що він підвищений в колоректальних пухлинах, що містять активуючі мутації KRAS. Такі мутації поширені при мієломі, але рідко - при неходжкинській лімфомі. Крім того, ця мікроРНК розташована в безпосередній близькості від кластеру HOX A, який є важливим регулятором гемопоезу, аберативно виражений в АМЛ та мієломі. Цікаво, що однією з цілей miR-148a, спільною для множинних алгоритмів прогнозування (PicTar, TargetScan та miRanda), є MAFB, загальне генетичне ураження мієломи. Інші мікроРНК асоціювались не виключно з діагностичною класифікацією, такою як miR-153, яка, хоча і сильно виражена в HL, але не в інших B-клітинних лініях або лімфоцитах, також була підвищена в клітинних лініях T-ALL (Рисунки 4e та i ).

Рівні експресії мікрорінок мікрочипів різно виражені (модифікований P 2 виявив, що клітинні лінії типу ABC (OCI-Ly3, OCI-Ly10, HLY-1 та HBL-1) та клітинні лінії типу GCB (SU-DHL4, SU-DHL6 та SU- DHL10) були чітко згруповані (рисунок 1), з miR-155, miR-221, miR-222 та miR-21, регульованими в клітинних лініях ABC, і ми розширили ці висновки до miR-363 та miR-518a (які не були включені Ми також виявили мікроРНК, які були регульовані в клітинних лініях типу GCB, включаючи miR-181a, miR-590, miR-421 та miR-324 (малюнки 4m та n), і ми в процесі вивчення рівнів експресії ці мікроРНК у клінічних зразках DLBCL, як було продемонстровано раніше, більш високі рівні miR-155, miR-21 та miR-221 були пов'язані з імунофенотипом ABC у пацієнтів.

Для порівняння гематологічних злоякісних новоутворень ми дослідили лімфобластоїдні клітинні лінії, отримані від лімфопроліферативного розладу PPBL. Ці клітинні лінії продемонстрували значну регуляцію miR-132 та miR-155, тоді як miR-550 та miR-641 були зменшені (Малюнки 4b та g). Цікаво, що було виявлено, що як miR-132, так і miR-155 індукуються стимуляцією ендотоксинів, можливо, це відображає асоціацію із сильним курінням, яка характерна для цього розладу.

Рівні експресії мікроРНК, отриманих від EBV, у клітинних лініях, інфікованих EBV, як вимірюється мікрочипом. Для порівняння було включено лінію клітин EBV Ramos.

Повнорозмірне зображення

Цікаво, що експресія miR-155 у BL також пов'язана з латентними інфекціями типу III EBV. Відповідно до цієї ідеї ми виявили, що miR-155 сильно експресується в клітинних лініях PPBL Raji та Granta-519, але не в клітинній лінії EBV-BL Ramos або лінії клітин YT, інфікованих латентністю II типу. Однак, як уже зазначалося, ми не знайшли експресії цієї мікроРНК у Daudi. Це може бути пов'язано з аномальним характером зараження EBV у цій клітинній лінії, яка має делецію, включаючи EBNA2 та частину EBNA5, і не має експресії LMP.

Хоча інші дослідження виробництва мікроРНК включали деякі гематологічні клітинні лінії та/або підмножини лімфоцитів, 4, 5 на сьогоднішній день є найбільш комплексним дослідженням експресії мікроРНК у розвитку лімфоїдів та злоякісних новоутвореннях. Нещодавно Landgraf та співавт. 4 клонованих та секвенсованих 256 малих бібліотек РНК, що містять 98 кровотворних бібліотек. Хоча це не є еквівалентом безпосередньо, порівняння між дев'ятьма загальними клітинними лініями показало подібні схеми експресії (додатковий малюнок S4).

Через відсутність функціональної інформації, доступної для більшості ідентифікованих мікроРНК, їх роль у розвитку лімфоцитів та злоякісності може бути реалізована лише шляхом майбутніх досліджень, де це дослідження виявиться цінною відправною точкою.