гена

  • реферат
  • мета:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • вступ
  • методи
  • предметів
  • Антропометричні вимірювання
  • Оцінка будови тіла
  • Біохімічні аналізи
  • Біопсія жиру та виділення мРНК
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • обговорення
  • Обмеження навчання

реферат

Регуляторні процеси, що модулюють вироблення адипонектину, та механізми, що беруть участь у транскрипційній активності ядерного фактора κB (NF-κB) в людських адипоцитах, ще не до кінця вивчені. Метою нашого дослідження було оцінити взаємозв'язок між жиром у організмі, розподілом жиру, системним запаленням, резистентністю до інсуліну, лептином та рівнем генів експресії генів у сироватці та підшкірній клітковині фактора некрозу пухлини альфа (TNF-α), адипонектину та каппи. Інгібітор В-альфа. (IkB-a) у пацієнтів з широким діапазоном індексу маси тіла (ІМТ). Ми також хотіли визначити, яка з цих змінних найбільш пов’язана з експресією гена адипонектину та здатністю транскрипції адипоцитів NF-κB.

методи:

Всього було досліджено 27 жінок у віці від 50 до 80 років з ІМТ від 22,1 до 53,3 кг/м2. У всіх суб’єктів ІМТ, окружність талії, склад тіла за допомогою подвійної рентгенівської абсорбтометрії, тригліцериди, холестерин, холестерин ліпопротеїдів високої щільності (HDL-Ch), глюкоза, інсулін, моделі гомеостазу, оцінка інсулінорезистентності (HOMA), високочутливий C реактивний оцінювали білки (hs-CRP), адипонектин в сироватці крові, лептин та TNF-α. Біопсії підшкірної жирової тканини брали з черевної порожнини всіх суб’єктів та визначали рівні іРНК адипонектину, TNF-α та IkB-α.

результати:

ІМТ та окружність талії були позитивно пов'язані з лептином, HOMA та hs-CRP, а негативно - з HDL-Ch; смуга також була пов'язана з адипонектином та мРНК IκB-α. HOMA негативно асоціювався з адипонектином сироватки та мРНК адипонектину. Hs-CRP був негативно пов'язаний з мРНК IκB-α і позитивно асоційований з HOMA. Для визначення комбінованого впливу ІМТ, окружності смуги, тригліцеридів, ЛПВЩ, HOMA, hs-CRP, лептину, сироватки та мРНК TNF-α на експресію гена адипонектину був проведений множинний регресійний аналіз: окружність смуги та лептин були включені до найбільш прийнятне рівняння регресії для прогнозування експресії гена адипонектину (R2 = 0,43, Р = 0,006). Проводили послідовний множинний регресійний аналіз, при цьому мкРК IκB-α вважали залежною змінною, а ІРМ, смугу, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP та аДіпонектин використовували як незалежні змінні. МРНК адипонектину була єдиною змінною, яка регресувала (R2 = 0,406, Р1,2). Було показано, що не всі люди з ожирінням мають високий рівень С-реактивного білка (СРБ), а лише ті, хто є резистентними до інсуліну. сильний зв’язок між інсулінорезистентністю та запаленням.

Жирова тканина експресує кілька генів, що кодують секреторні білки з широким спектром ефектів: 4 все більше доказів підтверджують ідею про те, що секреторні продукти адипоцитів беруть участь у механізмі, що поєднує ожиріння та резистентність до інсуліну, причому деякі покращують чутливість до інсуліну, а інші покращують його. Крім того, деякі з цих адипоцитокінів мають протизапальну дію, тоді як інші мають протизапальну дію. 4, 5

Адіпонектин - відносно недавно виявлений специфічний для жирової тканини білок, є сенсибілізуючим до інсуліну, має протизапальну дію 4, 5, 6, 7 і має нижчі концентрації у плазмі крові у пацієнтів із ожирінням, ніж у бідних людей. 4, 5, 6, 8 Взаємозв'язок між адипонектином та чутливістю до інсуліну сильніший, ніж взаємозв'язок між адипонектином та ожирінням. 9 Відмічена зв'язок між адипонектином та СРБ. 10, 11 Взаємозв'язок між запальними маркерами, інсулінорезистентністю, лептином, абдомінальним ожирінням та експресією гена адипонектину все ще обговорюється.

Ці взаємозв'язки виявляються особливо актуальними, оскільки нещодавно було показано, що адипонектин може діяти як місцевий регулятор запалення в підшкірних адипоцитах самців свиней, де він діє, пригнічуючи ядерний фактор kB (NF-kB). 12

NF-κB утримується в цитоплазмі завдяки взаємодії з інгібуючими білками сімейства інгібуючих факторів kappa B (IκB). 13, 14 У відповідь на широкий спектр клітинних подразників IκB-α дисоціюється від комплексу NF-κB, а потім протеолітично деградує. Цей процес включає фосфорилювання IκB-α членами сімейства IκB кінази (IKK). Деградація IκB-α призводить до "активації" NF-κB, що визначається як транслокація комплексу NF-κB з цитоплазми до ядра. Потрапляючи в ядро, NF-κB зв'язується зі специфічними елементами промотора ДНК та індукує транскрипцію відповідних генів, включаючи прозапальні цитокіни, кілька хемокінів та багато молекул адгезії клітин судинних ендотеліальних клітин 13, 14 (рис. 1).

Механізм активації NFκB.

Повнорозмірне зображення

Показано, що запальні подразники, такі як ендотоксин та цитокіни, індукують збільшення внутрішньоядерного NF-κB, тоді як протизапальні засоби викликають збільшення експресії IκB-α та рівня білка. 15, 16

Однак механізми, що регулюють активність NF-κB в адипоцитах людини, досі невідомі. Припускають, що адипонектин може мати місцеву протизапальну дію, збільшуючи експресію та рівень білка IκB-α в адипоциті.

Метою нашого дослідження було оцінити взаємозв'язок між жировими відкладеннями в організмі, розподілом жиру, системним запаленням, резистентністю до інсуліну, рівнями експресії генів лептину та TNF-α, адипонектину та IkB-α у сироватці та підшкірній жировій тканині у пацієнтів із широким діапазоном індексу маси тіла (ІМТ) та визначити, яка з цих змінних найбільш актуальна для експресії гена адипонектину та транскрипційної сили адипоцитів NF-κB.

Для оцінки системного запалення ми вимірювали hs-CRP, добре прийнятий сурогат, тоді як активність NF-κB оцінювали шляхом визначення експресії гена його інгібітора цитоплазми IκB-α.

методи

предметів

Було вивчено 27 жінок у віці від 50 до 80 років з показниками маси тіла (ІМТ) від 22,1 до 53,3 кг/м2.

Усі пацієнти мали гарне самопочуття, що визначали повна історія хвороби, фізичний огляд, а також нормальний аналіз крові, хімічна батарея та аналіз сечі. Усі особи мали стабільну вагу протягом попередніх 6 місяців і не мали ознак раку, печінки, нирок або щитовидної залози. У семи жінок була порушення толерантності до глюкози, а у двох жінок - цукровий діабет 2 типу відповідно до критеріїв Американської асоціації діабетиків. 17 Жоден із випробовуваних не отримував інсулін, тіазолідиндіони, будь-які протигіпоглікемічні або жирові препарати, а також регулярно не отримував протизапальних препаратів. Усі вони перебували в постменопаузі, а не на замісній гормонотерапії. Жоден з учасників регулярно не брав участі у фізичних навантаженнях.

Усі учасники дали інформовану згоду, а експериментальний протокол затвердив комісія з етики нашого університету.

Антропометричні вимірювання

Для випробовуваних із легким внутрішнім одягом та без взуття вагу тіла вимірювали з точністю до 0,1 кг (шкала Салуса, Мілан, Італія), а зріст - з точністю до 0,5 см за допомогою стадіометра (стадіометр Salus, Мілан, Італія). ІМТ розраховували як масу тіла, скориговану на квадрат (кг/м2). Окружність смуги була отримана з використанням вимірювальної стрічки як мінімальної окружності між відростком меду і пуповиною.

Оцінка будови тіла

Склад тіла вимірювали за допомогою двоенергетичної рентгенівсько-абсорбційної спектрометрії (DXA) (Hologic QDR 4500, Waltham, MA, USA).

Характеристики та фізичні концепції вимірювання DXA були описані в іншому місці. Щодня проводили 18 тестів забезпечення якості відповідно до інструкцій виробника. Потім усі скани були проаналізовані одним підготовленим дослідником. Загальний жир у тілі виражався у кг (FM) та у відсотках до маси тіла (FM%). Нежирна маса м’яких тканин (FFM) вважалася загальною масою тіла за вирахуванням загальної маси жиру та кісткової маси і виражалася в кг. Коефіцієнт варіації (CV) для подвійного визначення у 11 суб'єктів (жінки у віці 66-77 років) становив 1% для FM, 2,3% для FM% і 1,3% для FFM.

Біохімічні аналізи

Зразки венозної крові для всіх метаболічних визначень були отримані після нічного голодування. Глюкозу в плазмі крові вимірювали за допомогою аналізатора глюкози (Beckman Instruments Inc., Пало-Альто, Каліфорнія, США). CV у межах тесту становив 1,5%.

Імунологічно реактивний плазмовий інсулін піддавали повторним вимірюванням подвійним радіоімуноаналізом на антитіла з використанням комерційного набору (Diagnostic Products Corp., Лос-Анджелес, Каліфорнія, США). Чутливість становила 6 пмоль/л, а CV у тесті - 4,9%.

Інсулінорезистентність оцінювали за допомогою методу HOMA (оцінка гомеостазу інсулінорезистентності). 19

Рівні холестерину та тригліцеридів визначали за допомогою аналізатора Technicon Auto (Technicon Inc., Co., Тарітаун, штат Нью-Йорк, США), а осади декстран-магній використовували для відокремлення ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ).

Лептин у сироватці крові вимірювали за допомогою специфічного набору ELISA (DBC-Diagnostic Biochem Canada Inc., Лондон, Онтаріо, Каліфорнія). Чутливість становила 0,5 нг/мл, а CV під час тесту та інтертесту становив 7, 4 та 9, 6%.

Адипонектин в сироватці крові вимірювали за допомогою комерційно доступного набору ІФА (Linco Research Inc., Сент-Чарльз, Міссурі, США). Чутливість становила 0,5 нг/мл, а CV під час тесту та інтертесту - 7,4 та 8,4%.

TNF-α у сироватці крові вимірювали за допомогою комерційного набору (Medical Systems) методом хемоілюмінесценції; чутливість 1,7 пг/мл, CV у тесті та взаємовипробуванні становили 3, 6 та 6, 5%.

Hs-CRP вимірювали імунотурбідиметричним методом. Поріг виявлення становив 0,5 мг/л. Референтний інтервал становив 3 мг/л. Аналітична мінливість становила 5%.

Біопсія жиру та виділення мРНК

Біопсії жирової тканини брали вранці після голодування протягом ночі з підшкірної черевної порожнини. Біопсії брали аспіраційною голкою. Жирову тканину ретельно промивали ізотонічним сольовим розчином, а потім заморожували для подальшого вилучення РНК.

ПЛР у реальному часі (RT-PCR) дозволяє кількісно визначити РНК адипонектину, IkB-α та TNF-α. Коротко кажучи, загальну РНК витягували за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen, GMBH, Hilden, Німеччина) та зворотньо транскрибували, використовуючи Syntax Syncesis Kit для IScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). RT-PCR проводили з використанням термоциклера iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), використовуючи IQSYBR Green PCR SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) та 300 пмоль/мл кожної пари праймерів. Умови ампліфікації були такими: 95 ° С протягом 5 хвилин, 50 циклів при 95 ° С протягом 30 с, 60 ° С протягом 30 с і 72 ° С протягом 30 с. Праймери були розроблені та оптимізовані для праймерів, самовсмоктування, пропуску грунтування та довжини амплікону з використанням комерційного програмного забезпечення Beacon Design 4.0 (Premier Biosoft International, Пало-Альто, Каліфорнія, США). Всі грунтовки були розроблені з подібним вмістом ГХ і відпалювались при тій же температурі 60 ° C. Грунтовки постачає MWG Biotech AG (Еберсберг, Німеччина). Результати кількісно визначали як значення Ct, де Ct визначали як пороговий цикл ПЛР, при якому ампліфікований продукт вперше виявляли, і виражали як відношення цілі до контролю (β-актин).

Статистичний аналіз

Результати повідомляються як середні значення ± sd Логарифмічні перетворення проводились для незвичних змінних. Кореляція Пірсона була використана для перевірки зв'язку між змінними. Багаторазовий регресійний аналіз використовували послідовно та послідовно для тестування комбінованих ефектів незалежних змінних на експресію гена адипонектину та IκB-α.

Через велику кількість тестів, проведених для кореляційного аналізу, був прийнятий значний рівень P 20 для всіх змінних

результат

Основні характеристики досліджуваної вибірки наведені в таблиці 1.

Стіл в натуральну величину

У таблиці 2 наведено матричну кореляцію між антропометричним, FM% за DXA, метаболічними змінними, hs-CRP, адипонектином у сироватці крові, лептином, TNF-α та рівнями мРНК адипонектину, TNF-α та IkB-α.

Стіл в натуральну величину

ІМТ та окружність талії були позитивно пов’язані з лептином, HOMA та hs-CRP, а негативно - з HDL-Ch. Паспорт також був негативно пов'язаний з адипонектином та мРНК IκB-α. HOMA був негативно пов’язаний з HDL-Ch, адипонектином у сироватці крові, мРНК адипонектину та позитивно пов’язаний з лептином. Hs-CRP був негативно пов'язаний з мРНК HDL-Ch та IkB-α у сироватці крові, тоді як позитивно асоційований з HOMA.

Для визначення комбінованого впливу ІМТ, окружності талії, тригліцеридів, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, лептину, сироватки та мРНК TNF-α на експресію гена адипонектину був проведений множинний регресійний аналіз: були включені як смуга, так і лептин. у найбільш підходящому рівнянні регресії для прогнозування експресії гена адипонектину (R2 = 0,43, P = 0,006) (Таблиця 3).

Стіл в натуральну величину

Проведено послідовний багаторазовий регресійний аналіз, при цьому мкРНК IκB-α вважалася залежною змінною, а всі змінні, пов'язані з IκB-α, при бівариантних аналізах (ІМТ, окружність смуги, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP та мРНК адипонектину) як незалежні змінні. МРНК адипонектину була єдиною змінною, яка вступила в регресію (R2 = 0, 406, Р 4, 5, 6

Отримані нами результати щодо негативної зв'язку між обхватом талії та рівнями мРНК адипонектину узгоджуються з попередніми повідомленнями, які показали, що експресія гена адипонектину була нижчою у людей із ожирінням з абдомінальним ожирінням, ніж у пацієнтів з підшкірним ожирінням. 2, 4, 5, 21

Як і очікувалось, і відповідно до попередніх звітів 22 23, ми спостерігали значну зв'язок між ІМТ, смугою та резистентністю до інсуліну, як оцінювали HOMA, а також між ІМТ, смугою та hs-CRP. 1, 24

Раніше спостерігався сильний зв’язок між запаленням та ожирінням 1, а високий рівень hs-CRP був зареєстрований у 35% чоловіків та 60% жінок з ІМТ більше 30 кг/м2. Таким чином, хоча багато людей із ожирінням мають підвищений рівень hs-CRP, це не завжди так. Існує припущення, що поява інсулінорезистентності може бути однією з причин, чому люди з ожирінням виявляють високий рівень запальних маркерів. 3 Негативна асоціація між смужковою та адипонектиновою мРНК, рівнями мРНК адипонектину та HOMA та позитивна асоціація між hs-CRP та HOMA може означати, що адипонектин може бути асоціацією між абдомінальним ожирінням, резистентністю до інсуліну та запаленням. Тому дуже важливо вивчити механізми, що регулюють експресію гена адипонектину. Коли ми проводили послідовний множинний регресійний аналіз з використанням ІМТ, смуги, тригліцеридів, HDL-Ch, HOMA, hs-CRP, лептину, рівня TNF-α у сироватці крові та мРНК як незалежних змінних, а експресія гена адипонектину як залежна змінна, лише окружність смуги та лептин (із знижуючим та регулюючим ефектом) був включений до найбільш відповідного рівняння регресії та становив 40% варіації експресії гена адипонектину. Інсулінорезистентність, за оцінкою HOMA, була останньою змінною, вилученою із зворотної моделі у наших суб’єктів.

Ці дані свідчать про відсутність незалежної зв'язку між резистентністю до інсуліну, оціненою HOMA, та експресією гена адипонектину, і, судячи з усього, суперечать експериментам in vitro, проведеним Fasshauer et al., 25, які показали, що експресія гена адипонектину знижена. На противагу цьому, Lihn et al. 26 відзначили, що рівні мРНК адипонектину позитивно корелювали з чутливістю до інсуліну у здорових суб'єктів, але не у родичів пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу, припускаючи, що ця відсутність регуляції могла бути пов'язана із статусом резистентності до інсуліну у родичів діабетиків 2 типу.

Однак наші висновки про незалежну зв'язок між лептином та смугою експресії гена адипонектину дуже цікаві. Кілька досліджень in vitro не показали зв'язку між експресією гена лептину та адипонектину або справді негативною кореляцією, 27, 28, проте також пропонується посилення регуляції експресії гена адипонектину лептином. У наших людей рівні лептину були суттєво пов'язані з HOMA та окружністю талії, тоді як зв'язок між експресією гена лептину та адипонектину відбулася лише після корекції для пояса (r = 0,48, P = 0,016).

Наші дані також свідчать про те, що експресія гена адипонектину позитивно пов’язана з IκB-α, який, як відомо, рухає транскрипційну активність NF-κB. У наших людей мРНК IκB-α негативно асоціювалася з паспортом та hs-CRP і позитивно впливала на експресію гена адипонектину. При послідовному багаторазовому регресійному аналізі з використанням мкРК IκB-α як залежної змінної, мРНК адипонектину була єдиною змінною, яка увійшла в регресію, пояснюючи 40% дисперсії. Ці висновки доповнюють і поширюють попередні звіти. 7, 12 Фактично, раніше було показано, що адипонектин може інгібувати ендотеліальну сигналізацію NF-κB і що адипонектин може регулювати запалення адипоцитів свиней, частково інгібуючи фактор транскрипції NF-κB. Нещодавно було висловлено припущення, що активність адипоцитів NF-κB може відігравати важливу роль у контролі запалення та метаболічних змін, пов’язаних із ожирінням. Таким чином, значний незалежний взаємозв’язок між експресією гена адипонектину та мРНК IκB-α, який спостерігається у наших людей, свідчить про те, що коли експресія гена адипонектину висока, спостерігається вища експресія IκB-α та пригнічення транскрипційної активності NF-κB при нижчому запаленні на рівні адипоцитів.

Обмеження навчання

Ми повинні визнати деякі обмеження нашого дослідження. Спочатку ми протестували мРНК IκB-α замість активності. Отримані нами результати щодо низької мРНК IκB-α у людей із ожирінням слід інтерпретувати з обережністю і підтверджувати оцінкою активності IκB-α та мРНК, а також заходів активації NF-κB. Однак останнім часом використання RT-PCR для вимірювання мРНК IκB-α виявилося ефективним методом кількісного визначення сили транскрипції NF-κB. 29

По-друге, ми оцінювали резистентність до інсуліну за допомогою HOMA, добре прийнятої заміни, корисної в клінічних випробуваннях. Однак можна стверджувати, що роль резистентності до інсуліну в експресії гена адипонектину може бути більш актуальною, якщо ми використовуємо більш складні методи оцінки чутливості до інсуліну. По-третє, наші результати значного зв’язку між адипонектином та IκB-α можуть показати лише зв’язок між змінними, а не причинний зв’язок. Отже, наша гіпотеза про місцеву протизапальну дію адипонектину через інгібування активації NF-κB повинна бути підтверджена подальшими дослідженнями для оцінки причинно-наслідкових зв’язків.

На закінчення, наше дослідження чітко показує, що окружність талії позитивно пов'язана з резистентністю до інсуліну та hs-CRP, а негативно - з мРНК адипонектину та адипоцитами IκB-α, а отже, і з транскрипційною здатністю NF-κB. Отримані нами результати також показують, що ожиріння живота і лептин є незалежними провісниками експресії гена адипонектину; також припускають, що в людських адипоцитах експресія гена адипонектину сильно пов'язана з мРНК IκB-α.