реферат

Дослідити експресію антиапоптотичних та проапоптотичних маркерів у діабетичних сітківках.

методи

Всього було оглянуто 12 очей у шести суб'єктів із цукровим діабетом та 10 очей у п'яти осіб, які не хворіли на цукровий діабет без відомих захворювань очей, що служило контрольними суб'єктами. Імуногістохімічні методи застосовували з антитілами, спрямованими проти циклооксигенази-2 (Cox-2), Akt (протеїнкінази B), Mcl-1, Bad, цитохрому c, фактора, що індукує апоптоз (AIF), смерті, пов’язаної з білком рецептора-1 фактора некрозу пухлини (TRADD) та Fas-асоційований білок смерті (FADD).

результат

У сітківках у всіх суб’єктів без діабету цитоплазматична імунореактивність спостерігалася в гангліозних клітинах для антиапоптотичних молекул Cox-2, Akt та Mcl-1. Також повідомлялося про цитоплазматичне імунофарбування Cox-2 у пігментних епітеліальних клітинах сітківки. Повідомляється про слабку імунореактивність для мітохондріальних апоптогенних білків цитохрому c та AIF у внутрішніх сегментах фоторецепторів, у внутрішній третині зовнішнього плексиформного шару, у клітинах у внутрішньому ядерному шарі, у внутрішньому плексиформному шарі та в ганглії. клітин. Не було імунореактивності щодо інших досліджуваних антитіл. Всі діабетичні сітківки виявляли цитоплазматичну імунореактивність de novo щодо Bad у клітинах гангліїв та випадкових клітинах у внутрішньому ядерному шарі. Повідомлялося про підвищення імунореактивності цитохрому с та AIF. Імунореактивність Cox-2, Akt та Mcl-1 не змінилася у діабетичних сітківках. Не було імунореактивності на TRADD та FADD.

висновки

Гангліозні клітини діабетичної та недіабетичної сітківки експресують антиапоптотичні молекули Cox-2, Akt та Mcl-1. Гангліозні клітини сітківки експресують проапоптотичну молекулу Зло у відповідь на пошкодження нейронів, викликане діабетом. Діабетичні сітківки показують регуляцію білків мітохондріального цитохрому с та AIF.

Головний

Смерть клітин шляхом апоптозу, суворо контрольована подія під контролем генетичних програм, мабуть, відіграє важливу роль у розвитку та патогенезі діабетичних ускладнень. Кілька досліджень in vitro та in vivo показали, що окислювальний стрес, викликаний гіперглікемією, призводить до окислювального пошкодження нейронів, що в свою чергу активує шляхи смерті, пов'язані з апоптозом нейронів. 1, 2, 3 сітківки діабетичних щурів показали підвищений окислювальний стрес, а введення антиоксидантів пригнічувало розвиток ретинопатії. 4, 5, 6 Нещодавно було задокументовано посилений апоптоз клітин нервової клітини сітківки при експериментальному діабеті у щурів та цукровому діабеті у людей. Ця загибель клітин внаслідок апоптозу призводить до хронічної нейродегенерації, при якій нейрони втрачаються в діабетичній сітківці перед тим, як вдасться виявити інші гістопатології. 7, 8

Молекулярні механізми, що регулюють виживання нейронів та апоптоз сітківки у хворих на цукровий діабет, до кінця не виявлені. У попередньому дослідженні ми продемонстрували, що гангліозні клітини діабетичної сітківки виражають фактори, що сприяють апоптозу каспази-3, Fas та Bax, припускаючи, що ці клітини є найбільш вразливою популяцією. Виявлено ряд інших медіаторів, які є або антиапоптотичними, або проапоптотичними. Вони включають, але не обмежуючись цим, серин/треонін протеїнкіназу Akt (також відому як протеїнкіназа B), циклооксигеназу-2 (Cox-2), Mcl-1, Bcl-2-асоційований промотор смерті (Bad), цитохром c, апоптоз. індукуючий фактор індукції (AIF), пов'язаний з рецептором фактор некрозу-1 білок смерті домену (TRADD) та Fas-асоційований білок смерті (FADD).

Показано, що Akt захищає клітини нейронів від апоптозу, впливаючи на активність кількох факторів транскрипції, що беруть участь у регулюванні виживання клітин. 11, 12, 13, 14, 15, 16 Кілька досліджень показали, що Cox-2 функціонує як фактор виживання, захищаючи клітини від апоптозу. 17, 18, 19, 20, 21 Надмірна експресія Mcl-1, члена сімейства Bcl-2, 22, затримує апоптоз із широким спектром агентів. 18, 21, 23, 24, 25, 26 Зло - це проапоптотичний член сімейства генів Bcl-2, який сприяє апоптозу, зв'язуючи та пригнічуючи функції антиапоптотичних білків Bcl-2 та Bcl-xL. Мітохондрії відіграють ключову роль у контролі загибелі апоптотичних клітин. На початку апоптотичного процесу мітохондрії можуть виділяти кілька апоптотичних білків у цитозоль, такі як цитохром с та AIF. 27, 28 Домен смерті, що містить адаптери TRADD і FADD, діє як ключові білки в механізмі запрограмованої лігандом програмованої загибелі клітин (апоптозу), отриманого від рецепторів Fas (CD 95/APO-1) та рецептора некрозу пухлини типу 1. Вербування каспаза-8 через TRADD та FADD призводить до активації каспази та подальшого апоптозу. 29

Визначення молекулярних механізмів, що регулюють апоптоз нервових клітин у діабетичних сітківках, є корисним для розробки терапевтичних стратегій, які можуть забезпечити спосіб затримки або запобігання початку смерті нервових клітин сітківки у хворих на цукровий діабет. Тому ми використовували імуногістохімічні методи для вивчення експресії маркерів, пов’язаних з апоптозом Akt, Cox-2, Mcl-1, Bad, цитохрому c, AIF, TRADD та FADD в сітківці хворих на цукровий діабет та в сітківках хворих без діабету. .

методи

Навчання населення

Ми отримали 12 людських очей від посмертного донора від шести осіб із цукровим діабетом. У минулому жоден суб'єкт не мав фотокоагуляції сітківки. Ми також отримали 10 очей від п’яти осіб без діабету чи очних захворювань в анамнезі, як було встановлено грубим патологічним дослідженням. Очі донора були отримані та використані у дослідженні відповідно до положень Гельсінської декларації з дослідження людських тканин. Відразу після надходження зразків у лабораторію було зроблено 3-міліметровий розріз на задній частині лімба і рогівку, райдужку, кришталик та склоподібне тіло акуратно видалили. Сітківку ока та увеальну тканину відокремлювали від навколишньої тканини, фіксували у 4% параформальдегіді та вкладали у парафін.

Імуногістохімічне фарбування

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

В якості негативного контролю використовувались пропуск або заміна первинного антитіла на нерелевантне антитіло того ж виду та фарбування лише хромогеном. Як позитивний контроль використовували зрізи пацієнтів з колоректальним раком та раком молочної залози. Зрізи контрольних пацієнтів отримували у пацієнтів, які проходили лікування в університетській лікарні (Університет Льовена, Бельгія), у повній відповідності з принципами Гельсінкської декларації.

Усі розділи були розглянуті двома незалежними спостерігачами (AMA, KG). Один з них (КГ) не знав про походження зразків. У разі незгоди використовувались результати засліпленого спостерігача. Розбіжність між двома спостерігачами становила менше 5%. Фарбування оцінювали за наявністю або відсутністю імунореактивності, інтенсивністю імунореактивності, товщиною фарбування та однорідним або гетерогенним характером фарбування.

результат

Вік та стать донорів, тип діабету, тривалість діабету, наявність або відсутність артеріальної гіпертензії, статус ретинопатії, причина смерті та час смерті для енуклеації зведені в таблицю 3. Непроліферативна діабетична ретинопатія була задокументована у двох випадках. справи (випадки 1 і 2). Статус сітківки був невідомий у трьох випадках (випадки 3, 4 та 5). У цих очах не було гістопатологічних змін, що свідчать про діабетичну ретинопатію. В одному випадку (випадок 6) не було ретинопатії.

Стіл в натуральну величину

сітківках

Мікрофотографія сітківки хворих на цукровий діабет. Слайд негативного контролю, який обробляли однаково з нерелевантним антитілом, не мав маркування. НФЛ, шар нервових волокон; GCL, гангліозний клітинний шар; IPL, внутрішній плексиформний шар; INL, внутрішній стрижневий шар; OPL, зовнішній плексиформний шар; ONL, зовнішній серцевинний шар; ІС, внутрішні сегменти фоторецепторних клітин; ОС, зовнішні сегменти фоторецепторних клітин; RPE, пігментний епітелій сітківки. (Оригінальне збільшення × 100).

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Мікрофотографії сітківки від недиабетного суб'єкта, імуно забарвленого на циклооксигеназу-2, що показують імунореактивність у гангліозних клітинах (стрілки) (а) та фактор, що викликає апоптоз, що показує імунореактивність у внутрішніх сегментах фоторецепторів, у внутрішній третині зовнішньої третини в плексиформному шарі, в ядерній клітині шар, внутрішній плексиформний шар і гангліозні клітини (b). Скорочення визначено на рисунку 1 легенда. (Оригінальне збільшення × 100).

Повнорозмірне зображення

Подібні висновки були зареєстровані у всіх діабетичних сітківках. Цитоплазматична імунореактивність щодо Bad щодо novo спостерігалась у клітинах гангліїв та у кількох клітинах внутрішнього ядерного шару (рис. 3а). Підвищення регуляції гранульованого цитохрому с та імунореактивності AIF спостерігали у внутрішніх сегментах фоторецепторів, у внутрішній третині зовнішнього плексиформного шару, у клітинах у внутрішньому ядерному шарі, у внутрішньому шарі плексиформи та в клітинах гангліїв. На малюнку 3b показаний репрезентативний результат експресії цих білків. Розподіл та інтенсивність імунореактивності для Cox-2, Akt та Mcl-1 не змінились у діабетичних сітківках порівняно з сітківками у недиабетичних суб'єктів. Не було імунореактивності на TRADD та FADD.

Мікрофотографії сітківки у хворого на цукровий діабет, імунозабарвленого проти Бада, що показує імунореактивність гангліозних клітин (стрілки) (а) та фактор, що індукує апоптоз, що показує підвищення регуляції імунореактивності фактора, що індукує апоптоз (b). Скорочення визначено на рисунку 1 легенда. (Оригінальне збільшення × 100).

Повнорозмірне зображення

обговорення

У цьому дослідженні ми продемонстрували наступні моменти: (1) гангліозні клітини сітківки, конститутивно експресують антиапоптотичні молекули Akt, Cox-2 та Mcl-1; (2) діабет, індукований de novo експресією проапоптотичної молекули зла в клітинах гангліїв сітківки; та (3) діабетичні сітківки показали регуляцію білків мітохондріального цитохрому с та AIF.

Здається, протеїнкіназа серин/треонін Akt, ефект 3-кінази фосфатидилінозитолу (PI) 3-кінази (PI 3-кіназа), відіграє ключову роль у опосередкуванні виживання нейрональних клітин та нейропротекції. Оріке та ін. 11 продемонстрували, що виживання дорослих симпатичних нейронів за відсутності нейротрофічних факторів залежить від сигналізації PI 3-кінази/Akt. Кілька досліджень показали, що шлях PI 3-кінази/Akt відіграє важливу роль у опосередкуванні реакції на виживання клітин гангліозних клітин сітківки після аксотомії на різні фактори росту. 12, 13, 14 Крім того, апоптоз нейронів сітківки, індукований депривацією сироватки крові, зменшувався за допомогою інсуліну завдяки активації шляху PI 3-кінази/Akt. Крім того, сигнальний шлях PI 3-кінази/Akt сітківки активувався затиском зорового нерва і мав нейропротекторну дію на пошкоджені клітини гангліїв сітківки. 16 Відповідно до наших результатів, імунореактивність фосфорильованого Akt була виявлена ​​в клітинах гангліїв сітківки у пошкодженій сітківці. 16

Ферменти Кокса опосередковують вироблення простагландинів з арахідонової кислоти. Було виявлено дві ізоформи Кокса, Кокс-1 та Кокс-2. Кокс-1 конститутивно експресується в більшості тканин і вважається відповідальним за підтримання рівня простагландину для різних внутрішніх функцій. На противагу цьому, Cox-2 є продуктом безпосереднього раннього гена, який швидко індукується і жорстко регулюється. Експресія Кокс-2 може індукуватися в різних тканинах за допомогою патологічних подразників, таких як бактеріальні ліпополісахариди, прозапальні цитокіни, фактори росту, гормони та промотори пухлини. Хоча Cox-2 і називається індуцитивною ізоформою, конститутивно експресується в головному мозку, спинному мозку, яєчках, епітелії трахеї та макулярному денсі. У цих тканинах Cox-2 присутній без явних процесів стимуляції і вважається домінуючою ізоформою Cox. Було показано, що Кокс-2 суттєво сприяє фізіологічній регуляції та розвитку цих високодиференційованих систем органів. 17

Останні дані показали, що Кокс-2 і простагландини, що виникають внаслідок його ферментативної активації, беруть участь у контролі росту клітин, ангіогенезу, апоптозу та розвитку неоплазії. Селективний інгібітор Cox-2 послаблює ангіогенез сітківки, який супроводжує ретинопатію недоношених дітей та нормальний розвиток сітківки. Ці дані вказують на те, що Cox-2 відіграє важливу роль як у розвитку, так і в патологічному ангіогенезі сітківки. Крім того, кілька досліджень припускають роль Cox-2 у функціонуванні нейронів у мозку. 32, 33 Крім того, кілька досліджень продемонстрували пряму роль Cox-2 у забезпеченні стійких до апоптозу клітин шляхом збільшення експресії Mcl-1 шляхом активації шляху, залежного від PI 3-кінази/Akt. 18, 21 У цьому дослідженні цитоплазматична імунореактивність на Cox-2 спостерігалася в гангліозних клітинах сітківки, пігментних епітеліальних клітинах сітківки та пігментованих та непігментованих шарах епітелію війкового тіла у діабетичних та недіабетичних сітківках, що підтверджує попередні повідомлення. 31, 34, 35, 36 Експресія антиапоптотичних молекул Akt, Cox-2 і Mcl-1 в гангліозних клітинах сітківки може відображати той факт, що нейрони, як правило, підтримуються протягом життя людини.

У цьому дослідженні Bad виражався в гангліозних клітинах і в декількох клітинах внутрішнього ядерного шару у діабетичних сітківках. Ці спостереження дозволяють припустити, що гангліозні клітини сітківки посилюють погану експресію у відповідь на пошкодження нейронів, викликане діабетом. Подібні спостереження були описані Chen et al. 37, який продемонстрував, що індукована нейротоксинами дегенерація нейронів сітківки викликає de novo Погана експресія в клітинах гангліїв сітківки. Крім того, транзиторна ішемія сітківки через артеріальну оклюзію центральної сітківки спричиняє підвищення регуляції поганої експресії в клітинах шару клітин гангліїв та внутрішнього ядерного шару. 38

Кілька досліджень in vitro та in vivo показали, що окислювальний стрес, викликаний гіперглікемією, тісно пов'язаний з апоптозом у різних типах клітин. Оксидативний стрес бере участь у порушенні функції мітохондрій та активації запрограмованого шляху загибелі клітин каспази в нейронах діабету. 1, 2, 3 Існує безліч доказів участі активних форм кисню у спрацьовуванні мітохондрій для вивільнення декількох важливих гравців апоптозу, таких як цитохром c та AIF, у цитозоль. 28, 49 Кілька досліджень показали, що окислювальний стрес збільшується в сітківці при цукровому діабеті, і вважається, що він відіграє важливу роль у розвитку діабетичної ретинопатії. 4, 5, 6 Введення антиоксидантів пригнічувало активацію ферменту, що ініціює апоптоз каспазу-3, та пригнічувало розвиток ретинопатії. 5, 6 Нещодавно були показані індукована діабетом мітохондріальна дисфункція сітківки та підвищений викид цитохрому c у цитозольну фракцію, приготовлену із сітківки щурів. 50

Хоча ці спостереження за своїм описовим характером не дозволяють точно зрозуміти функцію цих молекул, вони припускають, що гангліозні клітини сітківки мають захисні механізми захисту від апоптозу, що гангліозні клітини сітківки виражають погано у відповідь на нейрони, індуковані діабетом. і що діабетичні сітківки показують регуляцію білків мітохондрій, таких як цитохром c та AIF.