- предметів
- реферат
- вступ
- Матеріали і методи
- предметів
- Хірургічні процедури
- Наркотики та мікроінфузії
- Процедури перевірки поведінки
- Експериментальний дизайн
- Перевірка місцезнаходження
- Статистичний аналіз
- результат
- Гістологічна перевірка місцезнаходжень та облік предметів, пропущених з аналізів
- Прийом їжі та води
- Харчовий мікроаналіз
- Ефекти мусцимолу в AIC
- Ефекти мусцимолу в vmPFC
- Ефекти CNQX та AP-5 у vmPFC
- Мікроаналіз питної води
- Швидка допомога та розведення
- обговорення
- Фінансування та розкриття інформації
- Додаткова інформація
- Документи Word
- Додаткова інформація
- Додаткова таблиця S1
- Додаткова таблиця S2
- Додаткова таблиця S3
- Додаткова таблиця S4
предметів
- Стільникова сигналізація
- Харчова поведінка
- Острів
- Префронтальна кора
реферат
У цьому дослідженні інфузії агоністів рецепторів ГАМК-А, мусцимолу всередині ділянки, використовувались для створення "тимчасових уражень" у щурів vmPFC та AIC. Потім проковтування та пов’язані з цим рухові дії були відзначені у двох мотиваційних ситуаціях: щури з дефіцитом їжі, представлені стандартними чау-чау та щури, що годувались довільно, зі смачним коктейлем із високим вмістом цукру/цукру. Основною метою було порівняти ефекти інактивації мусцимолу на умови годівлі та на різних ділянках, щоб визначити, чи має будь-яка з цих ділянок селективну роль у модулюванні експресії заниженої, контрольованої смаком дієти.
Матеріали і методи
Усі процедури були оцінені та схвалені Комітетом з питань інституційного догляду та використання тварин Університету Вісконсін-Медісон і відповідають вимогам, викладеним у Посібнику NIH з догляду та використання лабораторних тварин. Пристрої схвалені Американською асоціацією з акредитації лабораторних доглядів за тваринами.
предметів
У всіх експериментах використовували самців щурів Sprague-Dawley, отриманих від Harlan (Indianapolis, IN) вагою 275-290 г після прибуття в лабораторію. Щурів поселяли парами у прозорих клітинах з полікарбонату (ширина 9,5 дюйма x 17 дюймів, довжина 8 дюймів), з амбушюрами у віварії, контрольованому щодо світла та температури. Тварин розміщували у циклі 12:12 год світло/темно (світло світилось о 07:00). Їжа (гранули з щурячого чау Agway) та вода були доступні за бажанням, за винятком фаз обмеження їжі експериментів, як описано у розділі Експериментальне проектування. Щодня до тварин поводились обережно, щоб зменшити стрес.
Хірургічні процедури
Наркотики та мікроінфузії
Мусцимол, динатрій CNQX та AP-5 отримували від Sigma-Aldrich. Препарати розчиняли у стерильному 0,9% фізіологічному розчині. У випадку CNQX, сольовий розчин злегка нагрівали під час приготування лікарського засобу, щоб сприяти розчинності. Для внутрішньомозкових мікроінфузій щурів тримали обережно, інжектори опускали направляючими канюлями, а інфузії проводили зі швидкістю 0,32 мл/хв. Більш детальна інформація наведена у додаткових матеріалах.
Процедури перевірки поведінки
Тестування поведінки проводили в прозорих клітинах для поведінки з полікарбонату (ширина 9,5 дюйма х довжина 17 дюймів х висота 8 дюймів) з підлогою з дротяної сітки. Експерименти проводились за двох умов: (1) стан позбавлення їжі, при якому попередньо зважені кількості щелепових гранул пропонувались у тестовій клітці через 20 годин позбавлення їжі; аромат молочного шоколаду (далі - "шоколадний коктейль") . Цей коктейль складався з мальтодекстрину, сахарози, молочних та соєвих білків, олій кукурудзи та ріпаку, вітамінів та натуральних плюс штучні ароматизатори шоколаду (% ккал/порція: жир, 29; вуглеводи, 57; білки, 14). Шоколадний коктейль можна було придбати з верхньої мірної бюретки в тестовій клітці. Вода була доступна у всіх тестових умовах із верхньої об'ємної бюретки. Щурів оцінювали шляхом експериментальної обробки порожніх проб за допомогою реєстратора подій, підключеного до ПК. Моніторинг наступної поведінки:
Переходи клітини: переміщення вздовж центральної осі довгої осі клітини,
Тили: розведення на задніх лапах,
Годування: безперервні напади харчових гранул або шоколадного коктейлю
Вживання алкоголю: постійні напади водопостачання.
Були зафіксовані частота, тривалість та затримка для ініціювання всіх цих способів поведінки, за винятком переходів у клітці, для яких реєстрували лише частоту. Щоб записати тривалість даної поведінкової події, було натиснуто перемикач, який запускав автоматичний таймер (специфічний для цієї поведінки) на початку поведінки. Таймер вимикали, коли поведінку переривали інші способи поведінки (наприклад, щур, який зайнявся питною паузою, перестав пити назад або ходив по клітці амбулаторно). За даними частоти та тривалості була розрахована загальна середня тривалість кожного вирощування, годування або пиття.
Експериментальний дизайн
Були використані дві окремі групи щурів, з інфузійними канюлями, націленими або на vmPFC (n = 8 щурів), або на AIC (n = 8 щурів). Після відновлення після хірургічного втручання всім щурам робили «фіктивні ін’єкції», при яких ін’єкційні пробірки вводили в інфузійні канюлі, але не в мозок, щоб адаптувати щурів до роботи та інфузії.
Увечері в день змодельованої ін'єкції щурів поміщають у когорту, що не містить їжу, або в кран для шоколаду та коксу. Зокрема, половина щурів у кожній групі з місцем головного мозку потрапляла на обмежену дієту, при якій їжу приймали протягом ночі, за 20 годин до поведінкового сеансу наступного дня. Цим щурам дозволялося їсти за бажанням відразу після кожного сеансу спостереження за поведінкою та протягом тимчасового дня чи днів, що розділяли сеанси, а потім їжу знову видаляли за ніч до наступного сеансу тестування. Цей графік годівлі зберігався протягом усього експерименту. Інша половина кожної групи мозку отримувала за ніч у своїх домашніх клітках лише пляшку шоколадного коктейлю (за винятком звичної їжі). Це використовувалося для розміщення щурів у новій їжі. Відтепер щури отримували шоколадний коктейль лише під час 30-хвилинних сеансів спостереження (ніколи в домашніх клітках). Щури в півні від шоколаду та коксу не були позбавлені їжі.
Для подальшої адаптації щурів до мікроінфузії та процедур тестування, на наступний день після першого впливу дефіциту їжі або шоколадного коктейлю, усім щурам вводили фізіологічний розчин у відповідні цільові ділянки мозку та поміщали в поведінкові клітини за допомогою обох гранул чау. плюс пляшки з водою (для щурів з обмеженим харчуванням) або пляшки з шоколадними коктейлями плюс пляшки з водою (для щурів ad libitum) протягом 30 хвилин. Через два дні розпочалось тестування на наркотики.
У дні тестування на наркотики щурам вводили мусцимол (0, 30 або 75 нг) і негайно поміщали в поведінкові клітини. Безумовна рухова та поглинана поведінка відстежувались і реєструвались протягом 30 хвилин, як описано в Процедурах тестування поведінки. На цих зустрічах щурам пропонували або їжу та воду, або шоколадний коктейль та воду, залежно від їх групи. Кожна щур отримувала кожну дозу згідно з латинськими квадратними шаблонами в межах особи. Тестові дні були розділені принаймні на один тимчасовий день.
Після завершення всіх процедур обмежені групи їжі та шоколаду збовтували з ніг на голову, щурам давали 2 дні, щоб пристосуватись до свого нового режиму харчування, а вдруге всі дози препарату тестували у випробовуваних. Тому всі дози тестували на всіх щурах за умов позбавлення їжі + чау та ad libitum + шоколад.
Подібна експериментальна конструкція була використана для тестування ефекту антагоніста глутаматного рецептора AMPA, CNQX (0,1,5 мкг/стор.) Та антагоніста рецептора глутаматного NMDA, AP-5 (0, 1, 1,0 мкг)./стор.). Ефекти внутрішньо-vmPFC CNQX та AP-5 випробовували на окремих групах щурів (n = 8 на групу), причому порядок чау-чаю та шоколадного шейкера був збалансованим у щурів, як описано вище. Дози обох препаратів знаходились у діапазоні поведінково-активних внутрішньомозкових доз, про які повідомляється в літературі (Baldwin et al., 2000; Bishop et al., 2011; Mena et al., 2013; Tan et al., 2014).
Перевірка місцезнаходження
В кінці кожного експерименту щурів глибоко знеболювали пентобарбіталом натрію та перфузували транскардально 0,9% фізіологічним розчином, а потім 10% формаліном у фосфатному буфері. Мозок видаляли і зберігали у 10% формаліні. Коронарні зрізи (60 мкм) вирізали через місце інфузії на кріостатному мікротомі, зібрали на предметних стеклах, зафарбували крезил-фіолетовою, а потім перевірили, щоб перевірити правильність розташування інтракортикальних ін’єкцій. Зображення репрезентативних зрізів кожного експерименту були зроблені за допомогою програмного забезпечення Scion Image на комп'ютері, підключеному до CCD-мікроскопа Hitachi HV-C20.
Статистичний аналіз
Для досліджень мусцимолу внутрішньо-vmPFC та внутрішньо-AIG дані аналізували, використовуючи трифакторні ANOVA, з одним фактором між суб’єктами (область мозку) та двома факторами у суб’єкта (доза, тип їжі). Значний (с
Ілюстрація розташування наконечника інжектора в vmPFC (a) та AIC (b) та мікрофотографія місця в межах кожної ділянки (c, d). а) Чорні кола представляють місця з експерименту з мусцимолом, сірі кола представляють місця з експерименту CNQX, а білі кола представляють місця з експерименту AP-5. б) Чорні кола представляють місця експерименту з мусцимолом. (c) розташування vmPFC; fmi = corups callosum, передні щипці. (d) місцезнаходження АПК; pir = грушоподібна кора, ac = передня комісура, LV = бічний шлуночок. На панелях (c) і (d) стрілки показують наконечники інжектора.
Повнорозмірне зображення
- Завантажте слайд PowerPoint
В одного з восьми суб’єктів у дослідженні muscimol/AIG та у двох з восьми щурів у дослідженні AP5/vmPFC двосторонні розташування за межами цільових зон зменшились; у дослідженні CNQX двоє з восьми щурів захворіли і були принесені в жертву. Всі ці щури були виключені з аналізів.
Прийом їжі та води
Як показано на малюнку 2, вливання мусцимолу в АІК викликали різні ефекти на прийом, порівняно з інфузіями внутрішньо vmPFC (площа мозку x взаємодія дози: F (2, 26) = 3,9, P = 0,022). Подальші аналізи в кожній області мозку показали, що вливання мусцимолу в AIC (але не у vmPFC) суттєво зменшує споживання шоколадного коктейлю (F (2, 12) = 18, 5, P = 0,022, рисунок 2d), але не їжу (рис. 2b ). ), що підтверджено post-hoc аналізами, які вказують на значні відмінності між рецептурами, пов’язаними із сольовим розчином, порівняно з кожною з двох доз мусцимолу лише для шоколадного коктейлю. На відміну від прийому немовлят, спричиненого депривацією, інфузії мусцимолу в будь-яку область мозку не впливали (рис. 2а та б).
Вживання їжі з коксу та шоколаду ("Choc. Shake") після вливання мусцимолу в вентральну середню передньо-лобову кору ("vmPFC"; панелі а і в) або агранулярну острівну кірку ("AIC"; панелі b і d)). Дози мусцимолу для двосторонніх ін’єкцій вказані в нг/стор. Смужки помилок представляють одну SEM. *** П
Мікроаналіз споживання кишечника у непродовольчих щурів та вживання шоколадного коктейлю у щурів, яких утримували за необхідності після вливання мусцимолу в вентральну медіальну префронтальну кору (vmPFC) або агранулярну острівну кору (AIC). Тут наведено кількість (#) нападів, розпочатих за 30-хвилинний сеанс (панелі a і b), загальну тривалість годування за сеанс (панелі c і d) та середню тривалість судом за сеанс (панелі e і f). Дози мусцимолу для двосторонніх ін’єкцій вказані в нг/стор. б) * P + P + P
Вживання осколка, вживання шоколаду та мікроаналіз їжі та вживання шоколаду після інфузії антагоністів рецепторів глутамату AMPA/каїнату, CNQX (панелі a, c, e та g) або антагоніста рецепторів глутамату NMDA-AP-5 (панелі b, d, f та h). Позначки осей для мікроструктурних вимірювань такі ж, як описано в легенді на малюнку 3. Дози для двосторонніх ін’єкцій лікарських засобів наведені в мкг/стор. в) * P
Поведінка під час ходьби та розведення після вливань мусцимолу в вентральну центральну передньо-лобову кору ("vmPFC"; панелі а і в) або агранулярну острівну кору ("АІК"; панелі b і d)). Дози мусцимолу для двосторонніх ін’єкцій вказані в нг/стор. На панелях (a) та (c) * P