відображає

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Ультразвукове дослідження та гістологічні ознаки резус-мавп, що годували алкоголем
  • Плазмові характеристики виведених резус-мавп, що харчуються алкоголем
  • Зміни експресії гена печінки у мавп-резусів, що годуються алкоголем, із стеатозом печінки та фіброзом печінки
  • обговорення
  • методи
  • Введення тваринам та алкоголем
  • Збір крові та хімічні дослідження плазми
  • Ультразвукове дослідження та зразки біопсії печінки
  • Гістологічний аналіз
  • Аналіз мікрочипів експресії гена печінки
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Коментарі

предметів

  • Алкогольна хвороба печінки
  • Метаболічний синдром

реферат

Алкогольна хвороба печінки (АЛД) є серйозною проблемою охорони здоров'я, що має великі медичні та економічні труднощі. Етіологія АЛД ще не повністю зрозуміла. Розробка ліків та методів лікування АЛД ускладнюється відсутністю відповідних тваринних моделей, які б повторювали гістологічні та метаболічні властивості АЛД людини. Тут ми охарактеризуємо модель макакової мавпи стеатозу печінки та індукованого алкоголем фіброзу печінки, яка сумісна з клінічним прогресуванням біохімії та патології у людей з БА. Мікрочиповий аналіз експресії генів печінки проводили для виявлення потенційних молекулярних сигнатур прогресування ALD. У нашій моделі розрізу було виявлено підвищення регуляції експресії печінкових генів, пов'язаних зі стеатозом печінки (CPT1A, FASN, LEPR, RXRA, IGFBP1, PPARGC1A та SLC2A4), а також зменшення цих генів (CYP7A1, HMGCR, GCK) . і PNPLA3) та регуляція експресії гена печінки, пов’язаної з раком печінки (E2F1, OPCML, FZD7, IGFBP1 та LEF1). Наші результати показують, що ця модель ALD відображає прогресування клінічних захворювань та експресію генів печінки у людини. Ці висновки будуть корисними для поліпшення розуміння патогенезу АЛД та будуть корисними для розробки нових терапевтичних підходів та фармакологічних засобів для лікування АЛД.

Хронічна хвороба печінки, спричинена алкоголем, є основною причиною загальної захворюваності та смертності 1. У розвинутих країнах до 66% усіх хронічних захворювань печінки спричинені вживанням алкоголю, а зловживання алкоголем становить майже половину всіх смертей від захворювань печінки 2. Отже, алкогольна хвороба печінки (АЛД) є серйозною проблемою охорони здоров'я з високим медичним та економічним навантаженням. Хронічна хвороба печінки, спричинена алкоголем, - це прогресуюче захворювання з декількома гістологічними стадіями: жирова печінка (стеатоз), алкогольний гепатит, хронічний гепатит з фіброзом або цирозом печінки та гепатоцелюлярна карцинома 3. Однак етіологія АЛД до кінця не вивчена. На відміну від інших захворювань печінки, таких як вірусний гепатит, лікування АЛД не покращилось суттєво за останні десятиліття2. В даний час не існує ефективних широко прийнятих методів лікування АЛД 4, 5. Розробці ліків та терапії ALD заважає відсутність відповідних тваринних моделей, які б повторювали гістологічні та метаболічні властивості ALD2 у людини.

Профілювання експресії генів визначатиме виразно виражені шляхи та нові молекулярні мішені при ALD, і значні зміни в експресії генів вузлів були виявлені в біоптатах печінки пацієнтів з ALD 15. Розширення нашого розуміння патогенезу АЛД надасть цінну інформацію про стратегії профілактики та лікування АЛД. Тому, щоб забезпечити систематичну доклінічну оцінку ефективності та безпеки кандидатів на наркотики чи терапії АЛД людини, важливо, щоб моделі ALD резус-макаки відображали як клінічне прогресування захворювання, так і експресію генів. Однак експресія генів хронічного алкогольного ураження печінки у резус-мавп не вивчалася. У цьому дослідженні ми описали розробку моделей розрізу макаки при стеатозі печінки, алкогольному гепатиті та фіброзі печінки. Ми також виявили клінічний розвиток біохімії та патології АЛД на цих моделях тварин. Крім того, були проведені аналізи мРНК на основі серії тканин печінки тварин для виявлення потенційних молекулярних ознак прогресування захворювання та порівняння моделей експресії генів із моделями ALD людини.

результат

Шістнадцять макак-резусів годували спиртовим розчином протягом 3 років. Середньодобове споживання алкоголю протягом трирічного періоду становило 9,6 г/кг на день (діапазон: 6, 2–12, 1 г/кг на день) або 24% від загальної добової норми споживання калорій (діапазон: 16–42% ). Три контрольних тварини утримувались на однаковій дієті, але без алкоголю, і споживання їжі контролювали щодня.

Ультразвукове дослідження та гістологічні ознаки резус-мавп, що годували алкоголем

Мавп-резусів тримали на алкогольній дієті протягом 3 років. Тварини, які отримували алкоголь, продемонстрували всі стадії АЛД на основі УЗД та гістологічних досліджень. Ультразвукове дослідження печінки резус-мавп, що харчуються алкоголем, показало чіткий стеатоз печінки та фіброз печінки, на відміну від безалкогольного контролю (рис. 1). Гістологічне дослідження зрізів печінки, пофарбованих Н & Е, виявило розвиток легкого, середнього та важкого стеатозу печінки з некротичними змінами резус-макак, що харчуються алкоголем (рис. 2). На відміну від контрольних тварин, на ділянках печінки резус-мавп, що харчуються алкоголем, спостерігався стеатоз, включаючи гепатоцелюлярну вакуоляцію та накопичення макро- та мікровезикулярних ліпідів у гепатоцитах печінки (рис. 2в-год); Також спостерігались запалення та дегенерація балонів (рис. 2h). Крім того, гістологічне дослідження зрізів печінки, пофарбованих Массоном, показало фіброз печінки у резус-мавп, що годуються алкоголем (рис. 3). Окрема мавпа прогресувала через різні стадії стеатозу та стеатогепатиту.

Нормальна УЗД печінкової тканини ( a ): капсула печінки елегантна і гладка з лінійним, струнким, сильним відлунням, і в лінійному відлунні на стінці очеревини є невелика щілина. Печінкові паренхіматозні плями дрібні та рівномірно розподілені, система внутрішньопечінкових проток нормальна, текстура чітка і хороший звук хороший. УЗД жирової тканини печінки ( b, c ): капсула печінки елегантна і гладка, а край печінки тупий. Внутрішньопечінкове відлуння м’яке і щільно сплетене з нерівномірним відлунням. Внутрішньопечінкові судини були значно зменшені. УЗД тканин фіброзу печінки ( d - f ): поверхня печінки ( d ) нерегулярний і шорсткий, а паренхіма печінки нерівна з нерегулярними некротичними відкладеннями ( e, f ).

Повнорозмірне зображення

Гістологічні особливості в печінці резус-мавпи ( a, b ), а у резус-мавп годували алкоголем помірний ( c, d ), помірний e, f ) і важкий ( g, h ) стеатозом печінки (гематоксилін та еозин). У печінкових гепатоцитах може спостерігатися очевидна гепатоцелюлярна вакуоляція та накопичення макро- та мікровезикулярних ліпідів. Стрілка на малюнку 2h вказує на запальну інфільтрацію клітин.

Повнорозмірне зображення

Гістологічні особливості нормальних макак-резусів ( а, б ) та алкоголь у резус-мавп з алкогольним фіброзом ( c - h ). Осілі колагенові волокна щільно забарвлені трихромом Массона.

Повнорозмірне зображення

Плазмові характеристики виведених резус-мавп, що харчуються алкоголем

На основі оцінки гістологічних особливостей зрізів печінки тварин, які годували алкоголем, класифікували за стадією захворювання за ступенем тяжкості: легкий, середній та важкий стеатоз печінки та фіброз печінки. Також аналізувались функції печінки та ліпіди в сироватці крові, а кількість контрольних мавп, мавп з легким, середнім та важким стеатозом печінки та мавп з фіброзом становила 3, 3, 3, 6 та 3 мавпи (рис. 4а-h) Концентрації AST у сироватці крові у тварин із печінковим стеатозом та фіброзом були збільшені порівняно з контрольною групою (Р1) для легкого, середнього та важкого стеатозу печінки, а групи фіброзу печінки вказували на наявність АЛД у цих мавп (рис. 4г). Тим часом концентрація GGT у плазмі крові значно зросла у мавп із фіброзом печінки (P

Хімічні параметри сироваткової плазми для GGT, AST, ALT, AST/ALT, LDH, ALP, TG та CHOL ( а - год ) для резус-мавп із нормальною печінкою (відкрита лінія) та спиртів із резус-мавп з легким, середнім та важким стеатозом печінки (сірі смуги) та фіброзом печінки (чорний стрижень). Різні індекси над колонками вказують на суттєві відмінності (с

* Суттєво відрізняються контрольні та алкогольні макаки-резус-макаки з фіброзом печінки (P

Мікрочиповий аналіз зміни експресії гена печінки між контрольними макаками-резусом та макаками-резусом із стеатозом печінки ( a ) та фіброз печінки ( b ).

Повнорозмірне зображення

обговорення

Нарешті, ми охарактеризували модель мавпи стеатозу резус-мавп, алкогольного гепатиту та фіброзу печінки, яка сумісна з клінічним прогресом біохімії, патології та експресії генів печінки у людей з БА. Ця негуманна модель захворювань печінки у приматів буде корисною для покращення розуміння патогенезу АЛД та сприятиме розробці нових терапевтичних підходів та фармакологічних засобів для лікування АЛД.

методи

Введення тваринам та алкоголем

У цьому дослідженні використовували дев'ятнадцять дорослих резус-мавп (віком від 9 до 12 років), надані Kunming Biomed International. Усі тварини розміщувались індивідуально в приміщеннях для тварин із 12-годинним світловим: 12-годинним темним циклом. Температуру підтримували від 18 ° C до 26 ° C, а вологість від 40% до 70%. Тварин годували двічі на день комерційною їжею для мавп (LabDiet, Harlan Laboratories, Inc., США). Свіжі фрукти та овочі поповнювались раз на день. Усі процедури були затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Kunming Biomed International та виконувались відповідно до Посібника з догляду та використання лабораторних тварин. Установа для тварин акредитована Асоціацією з оцінки та акредитації Міжнародної лабораторії міжнародного догляду. Шістнадцять резус-мавп в експериментальній групі отримали 24 години доступу до підсолодженого цукру розчину етанолу. Початкова концентрація етанолу становила 5% (об./Об.), А концентрація етанолу зростала на 5% щотижня, поки не досягла кінцевої концентрації 25%. Три контрольні тварини отримали вільний доступ до води замість алкоголю.

Збір крові та хімічні дослідження плазми

Зразки крові отримували із стегнової вени секційних мавп, знеболених хлоридом кетаміну (10 мг/кг; Shenyang Veterinary Pharmaceutical Inc., Китай) приблизно о 9:00 ранку, після голодування 14 годин. Для хімічних плазмових аналізів сироватку крові відокремлювали центрифугуванням при 3000 об/хв. Протягом 15 хвилин. Наступні хімічні параметри плазми вимірювали за допомогою автоматизованого біохімічного аналізатора Roche Modular P800 (Roche Diagnostics Ltd., Базель, Швейцарія): γ-глутамілтранспептидаза (GGT, U/l), лактатдегідрогеназа (LDH, U/l), аспартатамінотрансфераза (AST, U/l), аланінамінотрансфераза (ALT, U/l), холестерин (CHOL, ммоль/л), тригліцериди (TG, ммоль/л). Аналізатор хемілюмінесценції ADC CLIA 400 (Addcare, Янтай, Китай) використовували для вимірювання плазмових маркерів плазми крові при фіброзі печінки, що включав сироваткову гіалуронову кислоту (HA), ламінін (LN), колаген IV (IV-C) та проколаген III N - кінцевий пептид (PIIINP).

Ультразвукове дослідження та зразки біопсії печінки

Кожні два місяці проводили ультразвукові дослідження. Після мінімум 6 годин голодування тваринам знеболювали кетамін хлоридом (10 мг/кг) шляхом внутрішньом’язової ін’єкції (ІМ), а також голили низ живота та гомілку. Печінку всіх тварин знімали через шкіру за допомогою ультразвукової системи Diasus (Dynamic Imaging Ltd., Лівінгстон, Шотландія, Великобританія), оснащеної лінійним перетворювачем від 5 до 10 МГц, який оцінює розвиток захворювань печінки. До біопсії резус-мавпам знеболювали шляхом ін’єкції ін’єкцією кетаміну хлориду (10 мг/кг) та морфіну гідрохлориду (0,2 мг/кг, Northeast Pharmaceutical Group, Китай). Потім проводили біопсію печінки за допомогою біопсійного пістолета Bard Monopty (Bard Biopsy Systems, Темпе, Арізона, США), заповненого одноразовою голкою для біопсії 16 калібру та наконечником з ехогенним покриттям (Bard Peripheral Vascular, Inc. USA) з простим черезшкірним введенням. проходження в правому нижньому міжконтинентальному просторі під керівництвом ультразвукової системи. Зразок тканини біопсії печінки розділили на дві рівні частини. Одну частину фіксували у формальдегіді для подальшого гістопатологічного аналізу, а іншу частину заморожували у рідкому азоті для подальшої екстракції РНК.

Гістологічний аналіз

Зразки тканин печінки, зібрані під час біопсії, ретельно фіксували у 10% нейтральному забуференному формаліні та вносили у парафін. Тканини, вкладені в парафін, вирізали і фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) та розчинами трихрому Массона (Masson). Зразки класифікували за накопиченням жиру та відкладанням колагену згідно з попереднім дослідженням досвідченого ветеринарного патолога, який був засліплений лікуванням, наданим тваринам 13. Коротко кажучи, середній показник жиру (ступінь 1) вказував на те, що 10-15% гепатоцитів містили вакуолі, середній бал жиру (ступінь 2) призначався, коли вакуолізація зростала до 15-30%, а важкий рівень жиру (ступінь 3) коли жир розподілявся на понад 40% гепатоцитів. Фіброз печінки характеризувався наявністю щільно забарвленого колагенового матеріалу.

Аналіз мікрочипів експресії гена печінки

Загальну РНК з тканин печінки з різних моментів біопсії, згідно експериментальної установки, витягували за допомогою мікронабору RNeasy (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США). Якість РНК визначали за допомогою спектрометрії агарозного гелю та електрофорезу перед полями ПЛР. Зворотну транскрипцію виконували з

1 мкг РНК з використанням набору перших ланцюгів RT2 (SABioscience, MD, США). Експресію гена печінки визначали за допомогою масиву печінки RT2 Profiler ™ з людською жирною печінкою та PCR-масиву раку людини Arcer (Qiagen, Frederick, MD, USA). Цільова група з 84 генів печінки включала гени, що беруть участь у регуляції сигналізації адипокіну та інсуліну, метаболічні ферменти та транспортери, а гени, які беруть участь у запаленні та апоптозі, використовувались для оцінки тканин тварин, класифікованих за гістопатологічними критеріями, для відображення характеристик, визначених за стадіями стеатоз печінки., який формував експресію 84 генів, що беруть участь у прогресуванні гепатоцелюлярної карциноми та інших форм гепатокарциногенезу, використовували для оцінки тканин тварин, класифікованих за гістопатологічними критеріями, для зображення фіброзу печінки. Кінетику експресії 84 ключових генів, що беруть участь у потенційних біомаркерах жирної печінки та раку печінки, аналізували одночасно з кожного поля ПЛР за допомогою онлайн-програмного забезпечення RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v4.0 (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США).,

Статистичний аналіз

Хімічні параметри плазми виражали як середнє значення ± SEM. Хімічні параметри плазми (GGT, AST, ALT, AST/ALT, CHOL, TG та LDH) у різних групах аналізували за допомогою одностороннього аналізу ANOVA (програмне забезпечення SPSS, SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США) та найменшу значущу різницю ( LSD). Тест був використаний для виявлення відмінностей. За допомогою t-критерію Стьюдента виявляли різницю в рівнях плазмових маркерів у контрольній та експериментальній групах. Для всіх аналізів Р був