Короткий опис

1 Еволюційна динаміка РНК-вірусу Семюеля Ойоснегроса Мартоса 14 листопада 2008 р. ДОКТОРАЛЬНА ТЕЗА Universidad Aut & o.

безкоштовно

Опис

Еволюційна динаміка РНК-вірусів Самуель Ойоснегрос Мартос 14 листопада 2008 р

ДОКТОРАЛЬНА ТЕЗА Universidad Aut´ onoma de Madrid Факультет наук Відділ молекулярної біології

Звіт, представлений випускником біології Самуелем Ойоснегросом Мартосом, щоб подати заявку на ступінь доктора філософії в Автономному університеті Мадрида. Мадрид, листопад 2008 р.

Робота, представлена ​​в цій докторській дисертації, проводилася в Центрі молекулярної біології "Severo Ochoa" під керівництвом доктора Естебана Домінго Соланса та фінансувалась докторантською стипендією з підготовки університетських кадрів (FPU) Міністерства освіти. і наук.

До Серхіо До моїх батьків

Дякую всім. РНКази не існують, загальна наука. тотальна наука.

SBF: Плодова бичача сироватка SDD: Залежність від щільності Відбір SPC: Поліклональна сироватка СНІД: Синдром набутого імунодефіциту ST: Стандартний геном 5 'UTR та 3' UTR: Неперекладені регіони 5 'і 3' кінців, відповідно VFA: Foot- вірус інфекції ротової порожнини ВГС: Вірус гепатиту С ВІЛ-1: Вірус імунодефіциту людини тип 1 VSV: Вірус везикулярного стоматиту ∆: Видалення

ACM: Моноклональні антитіла AZC: 5-азацитидин (AZC) BHK-21: Клітини нирок хом'ячка (Baby Hamster Nidney) кДНК: ДНК-копія d: DEAE на середній відстані: Діетиламіноетил Df: Ступінь свободи, ступінь свободи DIs: Дефект, що заважає частинки DMEM: модифікований Дульбекко мінімальний середній орел ДНК: дезоксирибонуклеїнова кислота dNTP: 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфат ecp: Цитопатичний ефект EDTA: Етил В тетрацетат діаміну FA: хвороба ящуру FU: 5-фторурацил G: гуаніпанініум hpe: Години після електропорації IRES: Внутрішня зона входу в рибосому Kb, Pb: Кілобази, пари основ LCMV: Мишачий лімфоцитарний вірус хоріоменінгіту M: Молярна MDI: Кратність зараження MP: Максимальна парсімонія MV: Максимальна ймовірність NJ: Приєднання сусідів nt: Нуклеотид PAQ: Аналіз розподілу квазівидів PBS: Солевий розчин, забуференний фосфатом, ПЛР: Ланцюгова реакція полімерази PFU: D-утворюючі одиниці Пластина PoliA: Поліаденілат PoliC: Полірибоцитидилат PV: Поліовірус R: Рибавірин ´ РНК: Рибонуклеїнова кислота RpRd: РНК-полімераза РНК-залежне RT: Реверсивна транскриптаза RT-PCR: Реакція зворотної транскрипції з наступним посиленням реакцією в тяжкому дихальному ланцюзі ГРВІ: гострий синдрому

Амінокислотний код A (Ala) Аланін I (Іле) Ізолейцин R (Arg) Аргінін C (Cys) Цистеїн K (Lys) Лізин S (Ser) Серин D (Asp) Аспарагін L (Leu) Лейцин T (Thr) Треонін E (Glu) Глутаміновий M (Met) Метіонін V (Val) Валін F (Phe) Фенілаланін N (Asn) Аспарагін W (Trp) Trypt´ ofano G (Gly) Гліцин P (Pro) Пролін Y (Tyr) Тирозин H (His ) Гістидин Q (Gln) Глютамін

Індекс 1. Резюме (резюме англійською мовою)

15 15 15 15 17 17 18 19 19 21 22 23 24 25 25 25 26 28

4. Матеріали та методи 4.1. Еукаріотична культура клітин. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Застосовані варіанти VFA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Інфекції . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1. Інфекції в рідкому середовищі клітинних моношарів. . . . . . . . . . . . . 4.3.2. Покриття вірусу на напівтвердому агаровому середовищі в клітинах BHK-21. . . . . . 4.3.3. Корекція титру при покритті популяцій дефектів, які інфікуються доповненням двох типів частинок . . . . . . . . . . .

28 30 30 30 30 31 31 31 32 33 33 34 37

40 40 40 41 41 42

43 43 43 43 44 44 44 44 45 45 45 45 45 45 46 46 46 46 49 49 50 51 51 51 52 52 52 54 54 56 56 56 57 57 57 57 58 58 59 59

112 112 113 113 114 114

. 114. 115. 115. 116. 116. 117. 117. 118. 118 . . . . . . .

119 120 121 121 121 121 122 123

8. Філогенетичний додаток

9. Математичний додаток: базова модель динаміки вірусів у 9.1. Конкуренція двох вірусів у культурі клітин. . . . . . . . . 9.2. Динаміка in silico проти динаміки in vitro. . . . . . . . . . . 9.2.1. Початкові умови. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2.2. Визначення кількості вірусу. . . . . . . . . 9.2.3. Модельні прогнози та експериментальні результати. 9.3. Параметри моделі. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4. Математичний аналіз. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.1. Закон про збереження. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.2. Простір параметрів . . . . . . . . . . . . . . . . . .

128 129 129 131 131 132 132 134 134 134 135

10. Комп’ютерний додаток 136 10.1. Вихідний код. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 11. Бібліографія

Резюме (резюме англійською мовою)

Генетична мінливість РНК-вірусів Молекулярні основи генетичної мінливості РНК-вірусів.

Частоти мутацій

Відносна біологічна ефективність

Рисунок 1: Схема квазівидової структури РНК-вірусів. Центральна діаграма представляє гетерогенний розподіл геномів, типовий для РНК-вірусів. Рядки представляють вірусні геноми, а символи над рядками - мутації. Під спектром мутантів вказується консенсус або середня послідовність розподілу. Початкові квазівиди в центрі можуть розвиватися до збільшення біологічної ефективності (широка стрілка), коли потрапляють під проходи з великою чисельністю популяції, або до зменшення біологічної ефективності (маленькі стрілки), коли піддаються послідовним вузьким місцям для популяцій або плита проходить. Країни з великою чисельністю популяції сприяють конкуренції між варіантами та призводять до збільшення відносної біологічної ефективності вірусу. Переходи від бляшки до бляшки призводять до стохастичного накопичення шкідливих мутацій та зменшення відносної біологічної ефективності вірусу.

Лахуе 1996). Крім того, РНК-полімерази схильні до ковзання, копіюючи гомополімерні зрізи, викликаючи делеції та інсерції (Bebenek and Kunkel 1993). Існують також сімейства клітинних білків, цитозин та аденозиндезамінази (APOBEC та ADAR), здатні редагувати вірусні геноми або транскрипти, як у гепатиту δ, вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) (Harris et al. 2003; Mangeat et al. 2003; Zhang et al. 2003), гепатиту В (Suspene et al. 2005) або навіть у ДНК-вірусах, таких як вірус папіломи (Vartanian et al. 2008). Ці види діяльності також можуть бути джерелом генетичних змін у деяких РНК-вірусах. 2.1.3.

Рекомбінація та перебудова генів.

Структура населення - квазівиди

Високий рівень помилок РНК-вірусів, їх короткий час геномної реплікації та великий розмір популяції, разом із дією природного відбору, конфігурують надзвичайну дарвінівську систему, в якій швидкість створення нових варіантів перевищує швидкість, з якою вони фіксований (Manrubia et al. 2005). Ця динаміка швидкої селекції-мутації в РНК-вірусах обов'язково призводить до співіснування безлічі варіантів у популяції, яка становить сукупність особин, тісно пов'язаних між собою, але не ідентичних. До цієї структури 17

Важливість спектру мутантів

Важливість спектру мутантів нещодавно була підкреслена двома паралельними дослідженнями, проведеними з мутантами вірусу поліомієліту (PV) (Pfeiffer and Kirkegaard 2003; Arnold et al. 2005), які показали збільшення вірності без шкоди для його реплікації ємність. Цей мутант породив квазивид з меншим різноманіттям, ніж вірус дикого типу. У заражених сприйнятливих мишей зменшення вірусного різноманіття призвело до втрати нейротропізму і, отже, послаблення фенотипу (Pfeiffer and Kirkegaard 2005; Vignuzzi et al. 2006). Розширення квазівидового різноманіття за допомогою хімічного мутагенезу відновило нейротропізм і патогенез. Ці результати встановлюють пряму залежність між швидкістю мутації, складністю спектру мутантів та вірусним патогенезом in vivo. 2.1.6.

Філогенез як інструмент вивчення будови квазивидів.

Біологічна ефективність вірусу: придатність

Біологічна ефективність або придатність вірусного варіанту - це очікуваний внесок цього варіанту до нащадків наступного покоління в певному середовищі (Maynard Smith 1998). Два

Процеси варіації біологічної ефективності

Вірус 1/Вірус 2

102 101 100 10-1

y = 0,318 e0,917x R2 = 0,9218

Рисунок 3: Типова схема вірусного змагання для визначення відносної придатності. Графік представляє частку двох вірусних варіантів у початковому інокулюмі (пасаж 0) та в кінці цитолітичної інфекції (протягом 4 пасажів). Кожна точка представляє результат зараження, отриманого вірусним препаратом попередньої інфекції. Нахил графіка представляє тимчасові зміни у частці кожного генотипу. Враховуючи, що приріст x (кількість проходів) дорівнює 1 у кожній точці, нахил у цьому випадку дорівнює e0,917 = 2,6 = відносна придатність.

Фітнес в деталях

важливо, що може змінити результат змагання в клітинах, коінфікованих різними вірусними варіантами (Baulcombe 1996; Bull and Molineux 1992; Chao 1997; Chao and Tran 1997; Gonzalez-Lopez et al. 2004; Grande-Perez et al . 2005b; Holland 1990; Novella et al. 2004; Russel 1992; Sachs and Bull 2005; Turner and Chao 1998; Turner and Chao 1999; Wilke et al. 2004b; Perales et al. 2007; Valcarcel and Ortin 1989; Holland et al. (1989), фітнес-дослідження можуть привести до дуже різних результатів залежно від ступеня коінфекції, дозволеного в експерименті. 2.2.3.

Еволюція стратегій вірусного фітнесу: вибір, залежний від щільності