реферат
Нещодавно ми повідомляли, що біорозкладаний полі [α- (4-амінобутил) -L-гліколева кислота] (PAGA) може конденсувати та захищати плазмідну ДНК від DNase I. У цьому дослідженні ми досліджували, чи системне введення pCAGGS мишачому IL-10 ( mIL -10) Експресійна плазміда, комплексована з PAGA, може зменшити розвиток інсуліту у мишей з діабетом, що не страждають ожирінням (NOD). Комплекси PAGA/mIL-10 у плазмі були стабільними більше 60 хвилин, але оголена ДНК була знищена протягом 10 хвилин за допомогою DNase I. Комплекси PAGA/ДНК вводили у хвостову вену 3-тижневих мишей NOD. Рівень mIL-10 у сироватці досяг піку через 5 днів після ін’єкції та може бути виявлений більше 9 тижнів. Поширеність тяжкого інсуліту у 12-тижневих мишей NOD була значно зменшена шляхом внутрішньовенних ін'єкцій комплексу PAGA/ДНК (15,7%) порівняно з ін'єкцією оголеної ДНК (34,5%) та необроблених контролів (90,9%). На закінчення, системне введення комплексів плазміди pCAGGS mIL-10/PAGA може зменшити тяжкість інсуліту у мишей NOD. Це дослідження показує, що комплекс PAGA/ДНК має потенціал для профілактики аутоімунного цукрового діабету.
Патологічною особливістю діабету 1 типу є опосередкована клітинами аутоімунна деструкція β-клітин острівців підшлункової залози (інсуліт). Недавнє дослідження показало, що внутрішньом’язове введення імунодепресивних цитокінових плазмід може ефективно придушити прогресування аутоімунного діабету на тваринній моделі діабету 1 типу (миша, що не страждає ожирінням, миша NOD).
Внутрішньовенне введення оголеної плазміди виражалося в печінці, легенях та селезінці. Однак плазмідна ДНК швидко виводиться з кровообігу через її широке поглинання печінкою та швидке розкладання плазмовою нуклеазою.456 Хоча було показано, що утворення комплексів, особливо з катіонними ліпосомами, підвищує стабільність ДНК та експресію генів, плазміда все ще швидко виводиться з плазми. циркуляція та ліпосомні/плазмідні комплекси токсичні для клітин.78 Нещодавно ми синтезували біологічно розкладаний катіонний полімер, полі [α- (4-амінобутил) -L-гліколеву кислоту] (PAGA). Цей полімер ефективно конденсує ДНК і менш цитотоксичний, ніж ФАПЧ. PAGA біологічно розкладається, не токсичний для клітин і збільшує трансфекцію в культивованих клітинах.9 Ми використовували PAGA як носій ДНК для системної доставки мишачого IL-10 (mIL-10) і досліджували, чи може ця полімерна система запобігати інсуліту у мишей NOD . У цьому дослідженні ми виявили, що синтетичний PAGA підвищував ефективність трансфекції плазміди pCAGGS mIL-10 in vitro. Комплекси плазми PAGA/mIL-10 можуть надходити в печінку після внутрішньовенного введення, і комплекси можуть пригнічувати прогресування аутоімунного інсуліту у мишей NOD.
результат
Формулювання та характеристика in vitro
Для підтвердження самостійного складання комплексів PAGA/плазміди було проведено дослідження затримки гелю. Збільшення співвідношення комплексів PAGA/плазміди було виявлено за допомогою електрофорезу в агарозному гелі 1,0%. Результати показали, що PAGA змогла конденсувати плазмідну ДНК у дрібні частинки у співвідношенні заряду 2: 1 (+/-) (рис. 1). Середній ефективний діаметр комплексів PAGA (2: 1, +/-), визначений за допомогою розсіювання світла, становив 179 нм. Стабільність у присутності ДНКази I є одним з основних параметрів системної доставки генів. Результати аналізу стабільності ДНКази I показані на малюнку 2. Вся оголена ДНК була знищена протягом 10 хвилин, але PAGA захищає ДНК від ДНази I понад 60 хвилин.
Комплекс PAGA/ДНК аналізували за допомогою електрофорезу із затримкою агарозного гелю. Доріжка 1, співвідношення заряду PAGA/ДНК 2: 1 (+/−); доріжка 2, 1: 1; доріжка 3, 1: 2, доріжка 4, 1: 3; доріжка 5, оголена ДНК. PAGA змогла захопити ДНК у співвідношенні заряду 2: 1 (+/−).
Повнорозмірне зображення
Розщеплення комплексів PAGA/ДНК перетравленням ДНКази I. Комплекси PAGA/ДНК готували у співвідношенні 2: 1 (+/-) та інкубували при 37 ° C. Для дисоціації плазмідної ДНК від PAGA було додано 37 мкл 1,0% SDS додали і комплекс нагрівали до 65 ° С протягом ночі. ДНК відокремлювали на 1,0% агарозному гелі. (а) оголена ДНК; (b) PAGA/ДНК-комплекс. PAGA змогла захистити ДНК більше 60 хвилин.
Повнорозмірне зображення
Трансфекція in vitro
Ми оцінили, чи має PAGA посилений ефект на доставку плазміди до клітин 293T (ATCC, Rockville, MD, USA). Ефективність опосередкованої PAGA трансфекції на клітинах 293T була значно вищою, ніж ефективність оголеної ДНК (P
Ефективність трансфекції in vitro ДНК комплексу PAGA/ДНК у клітинах 293T (1 мкг ДНК на лунку, 2 х 104 клітини на лунку). Через 24 години культури культуральне середовище збирали і рівень mIL-10 вимірювали методом ІФА. Значення вказують на середнє та стандартне відхилення.
Повнорозмірне зображення
RT-PCR-виявлення мРНК mIL-10 у печінці мишей NOD
Ми визначили наявність мРНК mIL-10, транскрибовану з внутрішньовенно введеного комплексу PAGA/ДНК методом RT-PCR. Для виключення продуктів RT-PCR із забрудненої плазміди pCAGGS або ендогенної мРНК mIL-10, праймери були розроблені для включення інтронної послідовності плазміди pCAGGS-mIL-10. Розмір бажаного продукту RT-PCR становив 222 пари основ. Як результат, mIL-10 мРНК була виявлена в печінці після внутрішньовенного введення як в оголеній, так і в групі комплексів PAGA/ДНК (рис. 4). Однак у печінці оголеної групи експресія плазміди mIL-10 знижувалась через 5 тижнів після ін'єкції, тоді як група комплексів PAGA/ДНК демонструвала подібний ступінь експресії до 9 тижнів після ін'єкції. Продукт RT-PCR селезінки та підшлункової залози не ідентифікований.
RT-PCR тканини печінки мишей NOD після внутрішньовенних ін'єкцій комплексів PAGA/ДНК (144 мкг PAGA/100 мкг ДНК, 2: 1, +/-). Доріжки 1-5, група, якій вводили комплекс PAGA/ДНК; доріжки 6-10, група, завантажена ДНК; смуга М, молекулярний маркер; групі С, PAGA вводив групу. Доріжки 1 та 6, через 1 тиждень після ін’єкції; смуги 2 і 7, 2 тижні; смуги 3 і 8: 3 тижні; смуги 4 і 9, 5 тижнів; смуги руху 5 і 10, 9 тижнів.
Повнорозмірне зображення
Експресія in vivo mIL-10 та інсуліту
Ми дослідили, чи можна придушити інсуліт мишей NOD після внутрішньовенних ін'єкцій плазмідного комплексу PAGA/mIL-10. Три тижневим самкам мишей NOD ін'єктували один раз 100 мкг плазміди mIL-10 з комплексом PAGA (PAGA: співвідношення заряду ДНК = 2: 1, 200 мкл, рН 7, 35 фосфатно-сольового розчину) у хвостову вену. У заплановані години мишей NOD приносили в жертву для взяття проб крові та печінки. Рівні IL-10 у мишачих сироватках вимірювали методом ІФА через 1, 2, 3, 5 та 9 тижнів після системного введення. Рівні сироваткового рівня NIL-10 у мишей, яким вводили PAGA/pCAGGS мишачий плазмідний комплекс IL-10 (група комплексів PAGA/ДНК), були значно підвищені, а експресія mIL-10 підтримувалася вище рівня контролю протягом більше 9 тижнів (P
Концентрація ІЛ-10 у миші. Кожна миша NOD отримувала внутрішньовенну ін'єкцію комплексів ДНК або комплексів PAGA/ДНК (2: 1, +/-, 100 мкг ДНК на мишу) у віці 3 тижнів. Рівні mIL-10 у сироватці крові вимірювали методом ІФА через 1, 2, 3, 5 та 9 тижнів. Жодної ін'єкційної групи (контрольної) не обстежували на 0. день. Значення вказують на середнє значення ± sem
Повнорозмірне зображення
Придушення інсуліту у мишей NOD після ін’єкції комплексів PAGA/ДНК (2/1, +/−) у хвостову вену в дозі 100 мкг плазміди pCAGGS mIL-10 на мишу. Інсуліт оцінювали шляхом фарбування більш ніж 20 острівців з кожної підшлункової залози гематоксилін-еозином та оцінки прогресування інсуліту. а) група, якій вводили PAGA; (b) група, якій вводили комплекс PAGA/ДНК; (c) група, якій вводили оголену ДНК; (г) ступінь інсуліту 0; (e) інсуліт 2 ступеня; та (f) інсуліт 4 ступеня.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Аутоімунний цукровий діабет є явним кандидатом для генної терапії. В принципі, найкращим способом лікування аутоімунного діабету буде виявлення людей, що перебувають у групі ризику, та лікування, щоб запобігти пошкодженню острівців.
У генній терапії основними перешкодами при лікуванні захворювань були транзиторна експресія та низька ефективність трансфекції плазміди. Повторні внутрішньовенні ін’єкції можуть бути одним із шляхів подолання цих основних бар’єрів. Попередні дослідження показали, що рівні експресії внутрішньовенно введеної оголеної ДНК неможливо виявити.1011 Однак нещодавнє дослідження показало, що рівні експресії були високими для швидкого внутрішньовенного введення великих обсягів оголеної ДНК.12 Внутрішньовенна доставка оголеної ДНК залишається проблемою. Захист плазміди від деградації нуклеазою може призвести до вищої ефективності трансфекції
Успішна доставка ДНК з цитоплазми до ядра важлива для розвитку систем генної терапії. Біорозкладані катіонні полімери були введені як система доставки генів, яка може покращити ефективність трансфекції. Вони можуть конденсувати ДНК і захистити її від деградації нуклеазою. Висока і тривала експресія плазміди була досягнута за допомогою біорозкладаного ефіру карнітину після внутрішньовенного введення мишам.
Іншим типом синтезованої біологічно розкладається генної системи є катіонні ліпіди. Катіонні ліпіди індукували вищу експресію трансгену, ніж інші ліпосоми, і їх деградація в клітинах збільшувала ДНК без внутрішньоклітинних клітин.16 Ми виявили, що внутрішньовенне введення біорозкладаних комплексів PAGA/ДНК викликало високу та тривалу експресію у мишей NOD. Цей результат свідчить про те, що деградація PAGA може збільшити ДНК без внутрішньоклітинних клітин. Потрібне подальше розслідування.
Вивільнення ендосом та дисоціація катіонного комплексу носій/ДНК перед транскрипцією необхідні для підвищення ефективності трансфекції. Надмірний позитивний заряд може бути перешкодою для дисоціації катіонного комплексу носій/ДНК.1718 Ми використовували комплекс PAGA/ДНК у співвідношенні заряду 2: 1 (+/−), що було мінімальним надмірним позитивним зарядом.
Недавні дослідження показали, що інфільтрація аутореактивної мононуклеарної клітини на острівці (інсуліт) спричинена дисбалансом цитокінів, що виділяються хелперними клітинами хелперного типу 1 (Th1) та типу 2 (Th2). 1920 Протизапальні цитокіни, що секретуються клітиною Th1 (IFN-γ та IL-2), підвищують запальний та опосередкований клітинами імунітет, тоді як протизапальні цитокіни, що секретуються клітинами Th2 (IL-4, 5, 6, 10 та 13), стимулюють гуморальний імунітет. клітини опосередковують аутоімунний інсуліт. Активація клітин Th1 у мишей NOD була пригнічена mIL-10, який може запобігти інсуліту та діабету.232425 Ця терапія рекомбінантними цитокінами показала низьку біодоступність, хімічну нестабільність та модульовану імунну відповідь. Профілактика розвитку діабету при NOD за допомогою mIL-10 залежить від віку. Попередні дані показали, що ін’єкція потрібна в молодому віці.1 Тому ми ввели комплекс PAGA/ДНК 3-тижневим мишам NOD для профілактики інсуліту. Плазміда pCAGGS не викликає неспецифічної індукції рівнів IL-10.1
Коротко кажучи, біодеградуючий катіонний полімер PAGA може конденсувати pCAGGS мишачу плазміду IL-10, захистити її від ДНКази I та збільшити ефективність трансфекції в клітинах 293T. Системне введення комплексів плазміди pCAGGS mIL-10/PAGA може зменшити тяжкість інсуліту у мишей NOD. Ці результати вказують на те, що PAGA є чудовим носієм для перенесення генів для внутрішньовенного введення плазміди mIL-10.
Матеріали і методи
Синтез PAGA
CBZ-L-оксилізин синтезували з CBZ-L-лізину шляхом діазотування з нітритом натрію та сірчаною кислотою з наступною екстракцією етиловим ефіром, а потім осаджували гасом. CBZ-L-оксилізин полімеризували конденсацією при 150 ° С у вакуумі від 10 до 4 Торр протягом 5 днів. Остиглий полімер розчиняли в хлороформі і осаджували метанолом. Висушений полімер розчиняли ДМФ, що містить паладій на вуглеці, і 85% мурашину кислоту додавали як донор протона. Через 15 годин при кімнатній температурі розчин полімеру виділяли з каталізатора фільтруванням. Додавали 2 н. HCl і полімер осаджували ацетоном. PAGA зберігали при -70 ° C до використання.
Три тижні самки мишей NOD були придбані у лабораторіях Джексона (Бар-Харбор, Меріленд, США) та утримувались у специфічних умовах без патогенів. Мишей NOD жертвували у запланований час шляхом вивиху шийки матки після наркозу методом інгаляції метоксифлураном (Schering-Plough Animal Health, Union, NJ, USA).
Приготування плазміди pCAGGS mIL-10
Мишача експресія плазмідної ДНК IL-10 pCAGGS посилювалась у ефективності субклонування DH5α кишкової палички (Gibco-BRL, Гейтерсбург, штат Медіка, США) та очищених максі-наборів Qiagen Plasmids (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США). Чистоту та ідентичність препарату плазмідної ДНК підтверджували вимірюванням поглинання при 260 нм та 280 нм та електрофорезом рестрикційного гелю розщеплених плазмід.
Приготування комплексу PAGA/ДНК
Комплекси PAGA/ДНК готували власноруч. PAGA (1,5 мг) розчиняли в 1 мл сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS, рН 7, 3). До 900 мкл PBS додавали сто мікролітрів розчину PAGA. Десять мікролітрів розведеного розчину PAGA повільно по краплях додавали до 1 мкл приготовленої плазміди гена ДНК (1,0 мг/мл) і залишали на 30 хвилин (співвідношення заряду PAGA/ДНК 2: 1). Формування комплексу PAGA/ДНК регулярно контролювали за допомогою 1,0% електрофорезу в агарозному гелі. 2627 Розмір частинок комплексу PAGA/ДНК визначали за допомогою динамічного розсіювання світла (BI-2030AT; Brookhaven Instruments, Holtsville, NY, USA).
Стійкість комплексів PAGA/ДНК
Співвідношення заряду (+/-) комплексу PAGA: ДНК становило 2,0 у PBS. Після утворення комплексу до розчину комплексу додавали ДНКазу I (10 одиниць, Gibco-BRL, Гейтерсбург, штат Меріленд, США), і суспензію комплексу інкубували при 37 ° С протягом 60 хвилин. Зразок 50 мкл комплексної суспензії відбирали через 0, 2, 5, 10, 20, 40 і 60 хвилин після інкубації, змішуючи з 75 мкл зупинного розчину (4 М ацетату амонію, 20 мМ ЕДТА і 2 мг/мл) . мл) і поміщають на лід. Для дисоціації плазмідної ДНК від PAGA додавали 37 мкл 1,0% SDS і комплекс нагрівали при 65 ° С протягом ночі. Після екстракції фенолом та хлороформом ДНК осаджували етанолом. Гранули розчиняли в 10 мкл буфера ТЕ і наносили на 1,0% електрофорез в агарозному гелі.
Трансфекція in vitro
Клітини NIH 293T (ATCC, Rockville, MD, США) культивували в 24-лункових планшетах (Corning, NY, USA) при концентрації 2 х 104 клітин на лунку протягом 24 годин. Культури ініціювали в DMEM (Gibco-BRL), що містить 10% плодової бичачої сироватки, доповнену 100 ОД/мл пеніциліну при 37 ° C протягом 24 годин з 5% CO 2. Ростове середовище видаляли і клітини промивали PBS. Після додавання середовища для трансфекції клітини 293T інкубували протягом 24 годин, потім середовище збирали і зберігали при -70 ° C до використання для аналізу експресії mIL-10.
Ланцюгова реакція полімеразної зворотної транскрипції (RT-PCR)
Загальну РНК виділяли з печінки миші NOD у заплановані терміни за допомогою системи мікроізоляційного спінінгового картриджа GlassMAX РНК (Life Technologies, Gaithersburg, MD, США). Зворотну транскрипцію проводили при 37 ° С протягом 1 години, використовуючи зворотну транскриптазу (Qiagen) та зворотний праймер. Конкретними олігонуклеотидними праймерами були 5'-GCTGGTTATTGTGCTGTCTC-3 'прямий праймер, 5'-CTCTAGGAGCATGTGGCTCT-3' зворотний праймер. Ці праймери були розроблені для включення інтронної послідовності, щоб можна було розрізнити будь-які можливі продукти ПЛР із забруднення плазмідної ДНК або геномної ДНК.1 Використовували такий цикл реакції ПЛР: 40 циклів при 94 ° С протягом 1 хвилини, 60 ° С протягом 1 хв і 72 ° C 1 хв 30 з подальшим продовженням на 10 хв при 72 ° C. Довжина очікуваних продуктів становила 222 пари основ. Продукти ПЛР аналізували електрофорезом на 1,0% агарозних гелях, візуалізованих за допомогою фарбування броміду етидію під УФ-світлом.
Аналіз миші IL-10 та вимірювання інсуліту у мишей NOD
Статистичний аналіз
Порівняння концентрації IL-10 проводили за допомогою критерію t Стьюдента. Значення Р нижче 0,05 вважалося статистично значущим.
Дякую
Автори дякують Expression Genetics Inc. за фінансову підтримку, а Джун-Ічі Міядзакі з Університету Осаки в Японії за щедру пожертву плазміди pCAGGS mIL-10. Ми хотіли б подякувати Трою Коху за технічну допомогу.