РОЗПОДІЛУ і біохімічної характеризації Ферменту 1,3- PROPANODIOL OXIDORREDUCTASE COMING з нативного штаму Clostridium SPP IBUN 158 NIXYOLLY ОЛЕКСАНДРИ CUCAITA Вескз Промислового Мікробіолог PUJ код 186286 МІКРОБІОЛОГІЇ поствузовского ІНСТИТУТ ІНСТИТУТ УНІВЕРСИТЕТУ мікробних THEESS До OPTITUTE ДЛЯ UNACULTURAL інституціональних БІОЛОГІЇ УНІВЕРСИТЕТ спеціалізованої вченої З КОЛУМБІЇ БОГОТА, КОЛУМБІЯ 2010

біохімічна

РОЗДІЛ І БІОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ЕНЗИМУ 1,3-ПРОПАНОДІОЛОКСИДОРРЕДУКТАЗИ ВІД РІДНОГО ШТАМУ Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ Промисловий мікробіолог P.U.J. Код 186286 Директор ДОЛЛІ Доцент кафедри групи біопроцесів та біопроспектів сольвентогенних мікроорганізмів ПІСЛЯ ДИСЦИПЛІНИ МІКРОБІОЛОГІЧНОГО ІНСТИТУТУ БІОТЕХНОЛОГІЇ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ КОЛУМБІЇ БОГОТА, Колумбія 2010

Тобі мама, вся моя вдячність і вічне кохання, що ти підтримуєш мене і завжди буваєш зі мною. Моїй дочці за її терпіння і любов, моїй сестрі за те, що вона є моїм безумовним другом, Дієго і всій моїй родині за підтримку цієї мрії, яка сьогодні є реальністю.

ДОКЛАД Д-р Доллі Монтойя Кастаньо за те, що я керував цією роботою, за те, що дав мені можливість працювати з нею та з дослідницькою групою, яка внесла більше, ніж знання, у моє життя. До моїх колег по групі: Джульєт Серрано, Ксімена Перес, Наталія Комба, Маурісіо Бернал, Герлінда Амаріс, Марія Анжеліка Пенья, Єнні Росіо Мартінес, Карлос Барраган, Герно Грусс, Андрес Гутьєрес та всі, хто так чи інакше є частиною лабораторії мікробіології. Аспірантуровому інтерфейсу мікробіології, особливо Сокорро Прієто за підтримку та співпрацю. Джону Флорезу за те, що він для мене як ангел, за його співпрацю та терпіння, велике спасибі. Ані Лучії Кастібланко та Хорхе Кортазару за готовність та допомогу. Моїм друзям з магістратури, особливо Вівіан, Мері, Кароліні, Оскітару та Алексісу, за те, що вони були такими хорошими друзями, підтримували мене і завжди були поруч, щоб дати мені добру пораду. Національному університету Колумбії за те, що зробив можливим завершення та завершення цього дослідження.

ЗМІСТ РЕЗЮМЕ 1. ВСТУП 1 2. ТЕОРЕТИЧНА РАМКА 3 2.1. Виробництво біодизелю 3 2.2. 1,3-пропандіол 4 2.3. Синтез 1,3-пропандіолу 5 2.4. Мікроорганізми роду Clostridium sp. 7 2.5. Фізіологія утворення 1,3-пропандіолу у Clostridium sp. 7 2.6. Ферменти дегідрогенази 9 2.6.1. Експериментальне вимірювання активності ферментів 11 2.6.2. Виявлення in situ ферментативної активності 1,3-пропандіолдегідрогенази 11 2.6.3. Отримання ферментів 12 2.6.4. Очищення ферментів 13 2.6.5. Визначення загальної концентрації білка 14 2.6.6. Ферментативна характеристика 14 2.7. Прогрес групи біопроцесів та біорозвідувань сольвентогенної лінії IBUN 16 3. ЗАГАЛЬНА ЦІЛ 18 3.1. Конкретні цілі 18 4. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 19 4.1. Мікроорганізми, середовища та умови культури 19 4.2. Кінетика росту 20 4.3. Отримання сирого екстракту білка 20

4.3.1. Виробництво сирого екстракту білка 20 4.3.2. Визначення білків флуорометричним методом 20 4.3.3. Визначення ферментної активності 21 4.4. Очищення ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази 22 4.4.1. Опади білка 22 4.4.2. Поділ та очищення ферменту 22 4.4.3. Перевірка очищення 22 4.4.4. Аналіз білка (PAGE) 23 4.5. Характеристика ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази 23 4.5.1. Визначення оптимальної температури 23 4.5.2. Визначення оптимального рН 23 4.5.3. Визначення кінетичних параметрів Km і Vmax 24 4.5.4. Вплив двовалентних іонів 24 4.5.5. Попередній тест для визначення молекулярної маси 24 4.5.6. Визначення ізоелектричної точки 25 5. РЕЗУЛЬТАТИ 26 5.1. Спосіб отримання сирого білкового екстракту 26 5.1.1. Робочі деформації 26 5.1.2. Кінетика росту 26 5.2. Отримання сирого білкового екстракту 27 5.2.1. Виробництво сирого екстракту білка 27 5.2.2. Активність ферментів 28 5.2.3. Калібрувальна крива для NAD + H 29 5.3. Поділ та очищення ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази 29 5.3.1. Опади білка 30

5.3.2. Розділення та очищення 31 5.3.3. Аналіз білка (PAGE) 35 5.4. Характеристика ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази 36 5.4.1. Вплив температури на активність ферменту 36 5.4.2. Визначення оптимального рН 37 5.4.3. Визначення кінетичних параметрів Km і Vmax 37 5.4.4. Вплив двовалентних іонів на активність ферменту 38 5.4.5. Попередній тест для визначення молекулярної маси 39 5.4.6. Визначення ізоелектричної точки ферменту 40 6. ДИСКУСІЯ 41 7. ВИСНОВКИ 51 8. РЕКОМЕНДАЦІЇ 52 9. БІБЛІОГРАФСЬКА ЛІТЕРАТУРА 53 10. ДОДАТКИ 61 10.1. ДОДАТОК 1. Стандартна крива NAD + H 61 10.2. ДОДАТОК 2. Визначення ферментної активності 63 10.3. ДОДАТОК 3. Крива росту Clostridium IBUN 158B у середовищі RCM (Oxoid) 64 10.4. ДОДАТОК 4. Крива зростання Clostridium IBUN 158 B у середовищі TGY 65 10.5. ДОДАТОК 5. Крива сухої ваги проти абсорбції (600 нм) Clostridium IBUN 158B у середовищі TGY 67 10.6. ДОДАТОК 6. Стандартна крива для визначення молекулярної маси 1,3-пропандіолдегідрогенази в поліакриламідному гелі в умовах денатурації 68

1,3-пропандіолдегідрогеназа 39 Рисунок 19. Відсоток активності ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази проти дії хлоридних солей 39 Рисунок 20. Оцінка молекулярної маси ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази у 10% поліакриламіду гелі в умовах денатурації 40 Рисунок 21. Крива NAD + H та рівняння лінії в спектрофотометрі Bio-Rad 61 Рисунок 22. Крива NAD + H та рівняння лінії в рідері TECAN ELISA 62 Рисунок 23. Кінетика необхідного часу для отримання вищої ферментативної активності 63 Рисунок 24. Крива росту Clostridium IBUN 158B у RCM 64 Середній Рисунок 25. Крива росту Clostridium IBUN 158B у середовищі TGY 66 Рисунок 26. Крива сухої ваги Vs Abs 600 нм Clostridium IBUN 158B у TGY 67 середовище Рисунок 27. Стандартна крива молекулярної маси, що використовується для оцінки маси ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази, забарвленого Кумасі Блаки 68 Рисунок 28. Стандартна крива молекулярної маси, що використовується для цього мармувати масу ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази із Зимограми 68

Таблиця 17. Кінетичні параметри, отримані з кривої сухої маси (г/л) проти Abs (600 нм) 67

3. ЗАГАЛЬНА ЦІЛ: Отримати, відокремити та охарактеризувати фермент 1,3-пропандіолдегідрогенази з нативного штаму Clostridium IBUN 158 B. 3.1. СПЕЦИФІЧНІ ЦІЛІ: Стандартизувати метод, який дозволяє отримувати сирий екстракт білка з культури штатного штаму Clostridium IBUN 158 B від Інституту біотехнології Національного університету Колумбії. Для оцінки методів розділення за допомогою гель-фільтрації та іонного обміну в системі FLPC для відділення ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази від штаму Clostridium IBUN 158 B. Визначте ферментативну активність, рН, оптимальну температуру, кінетичні параметри, масу молекулярних та вплив іонів на активність ферменту очищеної 1,3-пропандіолдегідрогенази 18

Попередньо пофарбований A 178 B 120 C 78 D 51 E 40 F 25 G 18 H 12 I 10 4.5.6. Визначення ізоелектричної точки Теоретично було визначено з урахуванням послідовності білка, отриманої Montoya (2008b) для ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази, опублікованої в базі даних NCBI для Clostridium IBUN 158B, а інструмент біоінформатики був використаний від інституту EMBnet біотехнології для обчислення ізоелектричної точки ферменту. 5. РЕЗУЛЬТАТИ 5.1. Спосіб отримання сирого білкового екстракту 25

5.2. Отримання сирого білкового екстракту 5.2.1. Виробництво екстракту неочищеного білка Оскільки фермент, що представляє інтерес для цього дослідження, є внутрішньоклітинним, одержання білків з Clostridium IBUN 158B проводилося обробкою ультразвуком, як описано в матеріалах методу. Було помічено, що в міру збільшення циклів кількість інтактних мікроорганізмів зменшувалася, а клітинний сміття збільшувався, що було представлено завдяки процесу лізису, який зазнали клітини (рис. 8). Рисунок 8. Фарбування за Грамом нативних штамів Clostridium. IBUN 158B після кожного з циклів та періодів ультразвукової обробки. Тест, проведений при 4 С, 60 КГц, з періодами часу 30 с. Клітини піддавали декільком обробці ультразвуком, і було встановлено, що оптимальні умови для отримання однорідності та більш високої продуктивності білка в зразках були досягнуті в 12 циклі, з часом 30 другий ультразвук, 27 разів відпочинку

1 2 3 4 Малюнок 13. Кольорове синє фарбування. Умови денатурації 10%. Свердловина 1: негативний контроль, свердловина 2: позитивний контроль, свердловина 3: чистий фермент 1,3-PDD, свердловина 4: 190 кДа MP. 5.4. Характеристика ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази 5.4.1. Вплив температури на активність ферменту В якості попереднього тесту для вибору діапазону температур, що підлягає оцінці, ферментативну активність зразків визначали в двох примірниках в діапазоні температур від 20 до 40 С. Отримані результати показали більшу ферментативну активність при температурі 30 С. З цих результатів оцінювали більш вузький діапазон температур, встановлений між 25 C і 31 C (рисунок 14), що дозволило нам підтвердити те, що було виявлено в першому дослідженні. Малюнок 14. Вплив температури на ферментативну активність у діапазоні температур від 25 до 31 С. 5.4.2. Визначення оптимального рН Вибір діапазонів рН, що підлягають оцінці, був зроблений з урахуванням досліджень, в яких оцінювали цей тип ферментів. На (фіг.15) ефект, який 36

Рисунок 16. Вплив концентрації 1,3-пропандіолу в мм на активність ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази з використанням концентрації 0,6 мМ НАД + Рисунок 17. Вплив концентрації НАД + коферменту на активність Фермент 1,3-пропандіолдегідрогенази, використовуючи концентрацію 1,3-пропандіолу 100 мМ 5.4.4. Вплив двовалентних іонів на активність ферментів На малюнках 18 і 19 показано вплив хлоридних солей та їх концентрацію на активність очищеного ферменту, чітко видно, що солі хлориду марганцю та хлорид кальцію є активаторами та потенціюють

активність ферментів, тоді як солі хлориду магнію пригнічують його активність до 19%. Марганець хлорид підвищує активність ферменту на 50% порівняно з 7%, що утворюється хлоридом кальцію Рисунок 18. Вплив двовалентних іонів на активність ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази Рисунок 19. Відсоток активності ферменту 1,3 -пропандіолдегідрогеназа проти дії хлористих солей. 5.4.5. Попередній тест для визначення молекулярної маси Беручи до уваги результати електрофорезу, отриманого після процесу очищення, і як спосіб визначення приблизної молекулярної маси ферменту, значення в мм шляху проходження смуг у гелю, використовуючи рівняння лінії, отриманої з розміру смуг вагового маркера 39

(190 KDA) на 10% поліакриламідних гелях (рис. 20). Отриманим результатом була маса 71,3 кДа для однієї смуги в фарбованому гелі Кумасі синього кольору і 74,5 кДа для смуги, про яку свідчить зимограма. 1 2 3 4 1 2 3 4 71,3 КДа 74,5 КДа (а) (б) Рисунок 20. Оцінка молекулярної маси ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази у 10% поліакриламідних гелях в умовах денатурації (а) Пофарбовані Кумасі Блю ( б) Зимограма. Свердловини (1) містять маркер комерційної ваги 190KDa (Bioline), а лунки (2-4) містять фермент 1,3-пропандіолдегідрогеназу після процесу очищення. 5.4.6. Визначення ізоелектричної точки ферменту За результатами, отриманими з використанням інструментів біоінформатики; теоретичний пі, що генерується з 385 амінокислот, отриманих із послідовності, встановленої Montoya (2008b) для ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази з Clostridium IBUN 158B, становить 5,85 40

7. ВИСНОВКИ Можна було встановити, що фермент 1,3-пропандіолдегідрогенази з нативного штаму Clostridium IBUN 158B виявляє алостеричну поведінку, яка збігається з біоінформаційними даними, отриманими групою Біопроцес, і яка знаходиться в процесі публікації. На ферментативну активність сильно впливають під час бродіння такі фактори, як рН та вироблення кислоти, які пов’язані з потоком відновників, таких як NAD + H. Оптимальні умови для отримання більш високої ферментативної активності були досягнуті при температурі 30 С, рН 10,0, концентрації MnCl 2 1 мМ, 1,3-ФД 100 мМ і НАД + 2 мМ. Було показано, що результат, отриманий для розрахункової молекулярної маси в рамках цього дослідження, не є надійним, тому рекомендується підтвердити його за допомогою гель-фільтраційної хроматографії та мас-спектрометрії. 51

8. РЕКОМЕНДАЦІЇ Необхідно очистити та охарактеризувати фермент гліцеролдегідратазу, оскільки він також відіграє важливу роль у перетворенні гліцерину в 1,3-пропандіол. Керуйте контрольованими умовами бродіння, що дозволяють генерувати більш високі значення активності ферментів, не впливаючи на вироблення кислот у процесі ферментації у флаконах. Для з'ясування поведінки метаболічного потоку в межах шляху гліцерину рекомендується провести аналіз ферментативної активності щодо виробництва кислоти. Для того, щоб підвищити активність ферменту 1,3-пропандіолдегідрогенази з нативного штаму C. IBUN 158B, необхідно використовувати деякі мікроелементи, такі як MnCl 2 і CaCl 2, у процесах ферментації із середовищем TGY та RCM 52