кофеїну

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Деградація кофеїну в H. Hampei
  • Біогеографічний аналіз мікробіома H. Hampei
  • Кофеїн-руйнуючі бактерії в кишечнику H. Hampei
  • Кисневі профілі в кишечнику H. Hampei
  • Відновлення деградації кофеїну в Росії H. Hampei
  • обговорення
  • методи
  • Зразки комах
  • Екстракція ДНК, ампліфікація ПЛР та високоефективне секвенування
  • Аналіз генів 16S рРНК
  • Виділення бактерій, що руйнують кофеїн, та їх ідентифікація
  • Скринінг генів ndmA в ізолятах і H. Hampei
  • Вимірювання O 2 за допомогою мікроелектродів
  • Час дієтичного транзиту в H. Hampei
  • Лікування та реінфекція антибіотиками
  • Виявлення кофеїну у зразках фрасу
  • Вплив антибіотиків на розмноження H. Hampei
  • прирости
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • відео
  • Додатковий фільм 1
  • Файли Excel
  • Додаткова інформація 1
  • Коментарі

предметів

  • ентомологія
  • Мікробна екологія
  • мікробіом

реферат

Кавова сівалка для ягід (Hypothenemus hampei) є найбільш руйнівним шкідником комах у світі, заражаючи комах і знижуючи їх врожайність до 80%. Кофеїн - це алкалоїд, який може бути токсичним для комах, і вважається, що він діє як захисний механізм, який інгібує травоїдних. Тут ми показуємо, що кофеїн розкладається в кишечнику H. hampei і що експериментальна інактивація кишкової мікробіоти усуває цю активність. Ми показуємо, що мікробіоти кишечника у зразках H. Hampei із семи основних країн-виробників кави та колоній, що вирощуються в лабораторіях, мають спільне ядро ​​мікроорганізмів. У всьому світі всюдисущі члени кишкової мікробіоти, включаючи видатні види Pseudomonas, живуть на кофеїні як на єдиному джерелі вуглецю та азоту. Гени дефетилази псевдомонади кофеїну експресуються in vivo в кишечнику H. hampei, а ревакцинація комах, оброблених антибіотиками, ізольованим штамом Pseudomonas відновлює здатність розкладати кофеїн, підтверджуючи їх ключову роль.

У комах, як і у інших тварин, розпад кофеїну може каталізуватися ферментами цитохрому Р450 20, 21. Однак жодні інші метазої не витримують концентрації кофеїну, яким піддається H. hampei, водночас виживаючи та завершуючи весь свій життєвий цикл виключно на зелених кавових зернах. Ми висунули гіпотезу, що деградація кофеїну у H. hampei зумовлена ​​в основному активністю його кишкової мікробіоти. Тут ми представляємо перше дослідження мікробіому H. hampei та його ролі у детоксикації кофеїну у комах. Наше відкриття мікробного компонента для перетворення кофеїну та існування H. hampei на кавових зернах має важливе значення для розуміння метаболізму та екології цього великого шкідника.

результат

Деградація кофеїну в H. hampei

Щоб перевірити гіпотезу про те, що деградація кофеїну є процесом, опосередкованим мікробами у H. hampei, ми отримали зразки з семи географічно розподілених регіонів виробництва кави: Кенії (Кіамбу), Індонезії (Східна Ява), Індії (Карнатака), Пуерто-Ріко (Ад'юнтас), Гаваї. (Кона), Гватемала (Коатепеке) та Мексика (Чіапас). Зразки з Індії включали комах, відібраних у обох домінуючих видів Coffea (C. arabica та C. canephora). Ми також використовували колонії з лабораторною допомогою, корінні з колумбійської популяції H. hampei та трьох інших видів ракоподібних, які не можуть жити на кавових зернах (H. crudiae, H. eruditus та Scolytodes maurus).

Спочатку ми протестували деградацію кофеїну після проходження через кишечник комах та визначили, чи відповідає за цей процес кишкова мікробіота. Ця гіпотеза була перевірена з використанням колонії H. Hampei в лабораторії, виведеної в контрольованому експерименті, із застосуванням штучної дієти (тут називається мінімальною дієтою), що містить зелені кавові зерна C. arabica з кінцевою концентрацією кофеїну 8 1,8-2,2 мг. . -1. Зразки Hypothenemus hampei вводили у флакони, що містять зазначену дієту, і демонстрували типову нудну активність (додаткова плівка 1) та вироблення фракцій. Кількість споживаної їжі та час перебування їжі в шлунково-кишковому тракті H. hampei визначали шляхом включення флуоресцентних сферичних показників у раціон. Час перебування, як правило, становив 3 години (додатковий малюнок 1) і відповідав вазі

Стіл в натуральну величину

a ) Експериментальне проектування та аналіз концентрації кофеїну у зразку H. hampei у контрольній пробі та на антибіотики. Виснаження мікробіому H. Hampei, опосередковане антибіотиками, усуває трансформацію кофеїну та збільшує секрецію кофеїну. b ) Профілі FTIR для чистого кофеїну (чорний), контролю (комах без антибіотиків - червоний) та обробленого антибіотиками фрагмента комах (зелений). Відображені профілі представляють середнє значення всіх вимірювань (n = 6).

Повнорозмірне зображення

Біогеографічний аналіз мікробіома H. hampei

Щоб визначити представників кишкової бактерії H. Hampei, які можуть сприяти деградації кофеїну, ми проаналізували бактеріальний склад мікробних спільнот H. Hampei, використовуючи секвенування гена 16S рРНК із зразків основних регіонів виробництва кави (додаткові дані 1). Філогенетичне β-різноманіття та ієрархічне групування показали поділ мікробів за географічним походженням (додаткова фігура 4). Непараметричний пермутаційний багатовимірний аналіз розсіяння був використаний для розподілу дисперсії мікробного складу серед ключових факторів. Географічне розташування пояснювало значну частину дисперсії (45%) бактеріального складу (додаткова фігура 4). У місцях, де змінювались сорти кави (Індія; C. arabica та C. canephora), сорти кави становили 78% відхилення у мікробному складі. Хоча домінуючі мікробні таксони також змінювались географічно, мережевий аналіз показав ядро ​​організмів, виявлене на всіх ділянках (рис. 2а). Ці організми були пов’язані, серед іншого, з рядами Pseudomonadales, Enterobacteriales, Turicibacteriales, Rhizobiales, Alteromonadales, Actinomycetales; тоді як псевдомонадалів було дуже багато у всіх відібраних зразках (рис. 2б).

a ) Філогенетичний аналіз мережі, що показує домінуючі групи бактерій, асоційовані із зразками H. Hampei із семи основних країн-виробників кави. До комах з Мексики належали також комахи інших видів, крім H. Hampei. ◊, H. Hampei, - S. maurus; A, H. crudiae; □, H. eruditus . b ) Акції Pseudomonas spp. послідовності в мікробіомі зібраних зразків.

Повнорозмірне зображення

Кофеїнодеградуючі бактерії в кишечнику H. hampei

a ) Кофеїновий градієнтний планшет, що показує колонії бактерій, виділених із шлунково-кишкового тракту H. Hampei, та їх ідентичність, визначену філогенетичним аналізом Основною групою отриманих ізолятів була P. fulva . b ) Філогенетичне дерево для послідовностей альфа-субодиниць альфа-деметилази кофеїну (NdmA), отриманих з ізольованих бактерій (жовтий), а також з РНК, вилученої з польових зразків H. hampei (зелений). c ) Чотиритижневі зразки H. Hampei, попередньо оброблені антибіотиками, були інокульовані P. fulva, щоб відновити їх здатність розкладати кофеїн, як було продемонстровано вимірюванням кофеїну FTIR та GC-MS у їх фракції (див. Таблицю 1).

Повнорозмірне зображення

Кисневі профілі в кишечнику H. hampei

Градієнти кисню вимірювали в кишечнику H. hampei за допомогою мікроелектродів. Всі вимірювання проводились у передній половині жука (див. Додаткову фігуру 1). Під час цих процедур кінчик електрода виносили на поверхню кишкової стінки і утримували в положенні, поки виміряні концентрації O 2 не стабілізувались. У всіх випадках, коли наконечник проникав у кишкову стінку, концентрація кисню зменшувалась із крутими градієнтами, що переходили від мікроаерофільних умов до зменшеного анаеробного ядра (рис.

На малюнку показано кисневі профілі трьох кишок жуків. Зверніть увагу на перехід від мікроаерофільної області до анаеробного ядра в просвіті передньої середньої кишки (див. Додатковий малюнок 1).

Повнорозмірне зображення

Відновлення деградації кофеїну у H. hampei

Лабораторні зразки H. Hampei, оброблені антибіотиками, спочатку годували мінімальним раціоном, що містив P. fulva, протягом 1 тижня. Потім комах переводили на свіжоприготовлену стерильну мінімальну дієту і давали їсти протягом 4 годин до того, як фракція була зібрана, а концентрація кофеїну була визначена кількісно. Аналізи GC-MS та FTIR показали майже повне виснаження вмісту кофеїну у фракції повторно інфікованих комах (рис. 3в, таблиця 1). Також була перевірена репродуктивна здатність комах, оброблених антибіотиками та P. fulva. Комахи не відновили здатність до розмноження після вакцинації P. fulva (додатковий малюнок 3).

обговорення

Хоча іноді комах годували насінням кави 24, H. hampei - єдина комаха, яка спеціалізується на годівлі та закінченні всього життєвого циклу виключно кавовими зернами в ягодах 16, 25. Під час виживання в цьому середовищі H. hampei піддається хронічному впливу кофеїну, відомого як токсичний алкалоїд 3, 5, 7, 9, 10, що робить цю комаху привабливою модельною системою, в якій можна оцінити роль мікробів у адаптації тварин до незвичного середовища. У цьому дослідженні ми перевірили, чи не руйнується розкладання кофеїну в H. hampei кишковим мікробіотом комах.

Члени кишкової мікробіоти H. Hampei були ідентифіковані від комах, зібраних із семи країн-виробників кави та лабораторних колоній. Розрахункові аналізи розподілу та дисперсії β-різноманітності показали, що склад мікробіома H. Hampei був суттєво пов’язаний з географічним походженням кави, а також з видами кави, де вона варіювала (див. Додаткові дані 1). Утворення морфокриптичних одиниць раніше було продемонстровано у зразках H. Hampei, відібраних з різних країн-виробників кави, шляхом аналізу мікросателітних маркерів та послідовностей генів COI 30. Ці "видові комплекси", про які повідомляється, разом з нашими висновками про географічні зміни мікробних спільнот у H. hampei можуть свідчити про коеволюцію комах та їх мікробіотів. Вміст кофеїну значно варіюється між оціненими видами кави 31, і хоча його тут не тестували, концентрація кофеїну може бути ще одним важливим фактором, що впливає на склад мікробіом кишечника H. Hampei.

Для підтвердження ролі P. fulva у деградації кофеїну in vivo лабораторні зразки, оброблені антибіотиками, повторно заражали P. fulva. Потім комах годували стерильним мінімальним раціоном, а їх фракції збирали для кількісного визначення кофеїну. Це продемонструвало, що повторна інокуляція P. fulva відновила здатність H. hampei розщеплювати кофеїн (рис. 3в, таблиця 1), підтверджуючи важливість цього члена мікробіоти кишечника в процесі детоксикації кофеїну. Щоб перевірити, чи може P. fulva допомогти H. Hampei відновити репродуктивну здатність, третю групу комах, оброблених антибіотиками, інокулюють P. fulva та використовують для оцінки придатності. Однак комаха не відновила здатність до розмноження після щеплення. Настільки складний процес, як розмноження, може вимагати належного стану поживності комах, який частково покладається на метаболічну активність асоційованих мікробів, або може вимагати присутності інших бактеріальних ендосимбіонів, які, як відомо, впливають на репродуктивне здоров'я 34. Визначення мінімального набору мікроорганізмів для відновлення репродуктивної придатності, а також порівняння впливу видів кави з різною концентрацією кофеїну на мікробні спільноти, пов’язані з H. hampei, є важливими темами для подальших досліджень.

Тут ми демонструємо, що H. hampei, найбільш згубний шкідник кави в країнах-виробниках кави, має спільне ядро ​​мікробіоти кишечника, яке ділиться між людьми з різних географічних районів, і що багато з цих організмів можуть існувати в кофеїні як єдиному джерелі. вуглецю та азоту. Ми також демонструємо, що мікробіота H. hampei відповідає за деградацію кофеїну в травному тракті комах. Мікробні спільноти відіграють важливу роль у всіх екосистемах - від участі у кругообігу поживних речовин у грунті до формування імунної системи людини 35, 36, 37. Наша демонстрація ролі кишкової мікробіоти у детоксикації кофеїну у H. hampei має важливе значення для розуміння метаболізму та екології цього важливого шкідника кави. Це також забезпечує нові можливості для розробки стратегій біоконтролю, де мікробіом представляє нову мету, оскільки роль асоційованих мікроорганізмів у покращеній здатності хазяїна виживати та домінувати у ворожому середовищі.

методи

Зразки комах

Зразки H. Hampei (n = 68; додаткові дані 1) були отримані з Кенії (Кіамбу), Індонезії (Східна Ява), Індії (Карнатака), Пуерто-Рико (Ад'юнтас), Гаваїв (Кона), Гватемали (Коатепеке) та Мексики ( Чіапас Додаткова інформація 1). Комах з Індії збирали з гібриду C. arabica та робусти (C. congensis × C. canephora). H. obscurus, H. crudiae та S. maurus були отримані із штамів листя Cecropia в Чіапасі, Мексика. З метою біогеографічного дослідження та порівняння були включені також штучні кавові ягоди 38 (лабораторні комахи). У всіх пунктах збору окремих комах поміщали живими в пробірки, що містять РНК (Ambion, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), і відправляли в лабораторію для аналізу.

Екстракція ДНК, ампліфікація ПЛР та високоефективне секвенування

Аналіз генів 16S рРНК

Виділення бактерій, що руйнують кофеїн, та їх ідентифікація

Скринінг гена ndmA в ізолятах та H. hampei

Вимірювання O 2 за допомогою мікроелектродів

Час дієтичного транзиту в H. Hampei

Лікування та реінфекція антибіотиками

Виявлення кофеїну у зразках фрасу

Для визначення концентрації кофеїну у зразках жуків, що лікувались антибіотиками, інфікованих антибіотиками та контрольних жуків, використовували дві стратегії: вимірювання кофеїну в сирій трісці за допомогою FTIR та вимірювання вилученого кофеїну з деревної тріски за допомогою GC-MS,

Для аналізів FTIR та GC-MS суттєві відмінності між лікуваннями (контрольне, антибіотикотерапевтичне та антибіотикотерапевтичне/повторно інокульоване) визначали шляхом одностороннього дисперсійного аналізу та найменших значущих відмінностей із використанням програмного середовища R 53. .

Вплив антибіотиків на розмноження H. Hampei

Нещодавно з’явилися сотня самок, коли дорослих поміщали по 20 чоловіків у флакони, що містять звичайну дієту, та інкубували протягом 14 днів, щоб максимізувати спаровування. Після первинної інкубації спарювання окремих жінок переводили у флакон, що містив або звичайну дієту (контроль), або дієту, доповнену антибіотиками (як описано вище), та інкубували протягом 44 днів. Третя група злучених самок отримувала антибіотики протягом 3 тижнів, вмирала з P. fulva і також інкубувала протягом 44 днів. П’ятнадцять флаконів від кожної обробки деструктивно збирали під час кожного відбору проб (дні 14, 24, 34 та 44) та проводили скринінг на наявність яєць, личинок, лялечок та дорослих особин. Була проведена логічна регресія щодо суми всіх фаз у кожному флаконі. Тоді модель була придатною лише з основними ефектами (дієта - контроль, антибіотики, інфекція та ЗРАЗОК - час відбору проб), де була включена надмірна дисперсія. Обидва основні ефекти були значущими, тобто є значний ефект DIET порівняно з контролем і є значний ефект зразка (пізніші зразки мали більшу кількість).