реферат
Цікавим результатом метилювання ДНК є приглушення транскрипції цілих хромосом, трансгенів, певних генів, що регулюються розвитком, і генів захворювань людини (Knight et al., 1993; Li et al., 1993; Norris et al., 1994). Метилювання на острові CpG призводить до зміни структури хроматину (Klein and Costa, 1997) і в деяких випадках безпосередньо перешкоджає зв'язуванню позитивних факторів з регуляторними елементами (Kass et al., 1997). Однак недавнє дослідження показало, що одне метилювання не може приглушити ген (Nan et al., 1997). У цьому процесі потрібні деякі метильовані білки, що зв’язують ДНК (MeCP). Оскільки багато повністю метильованих генів можна транскрибувати майже нормальними показниками за відсутності зв’язуючих білків метил-CpG, малоймовірно, що саме метилювання CpG зробить ці ділянки недоступними для базального апарату транскрипції або запобіжить взаємодії факторів транскрипції з промоторами.
Наша лабораторія бере участь у ідентифікації ключових промоторних елементів та факторів трансактивації, які модулюють транскрипцію МТ-I (Datta and Jacob, 1993, 1997; Aniskovitch and Jacob, 1997, 1998). Під час цього дослідження ми спостерігали, що цей ген не індукується в клітинах лімфосаркоми миші (P1798), на відміну від нормальної індукції в клітинах тимусу матері. Це дослідження було проведено для визначення потенційної ролі метилювання промотору у пригніченні експресії гена MT-I у клітинах лімфосаркоми.
результат
Клітини лімфосаркоми експресують гени MT-I або MT-II у відповідь на важкі метали лише після обробки 5-азацитидином.
Вестерн-блот-аналіз мРНК МТ-1 у клітинах лімфосаркоми до та після обробки 5-азацитидином та важкими металами. РНК, виділену (30 мкг) з контрольних клітин, і клітини, оброблені 5-AzaC (2,5 мкМ) протягом 72 годин, розділяли електрофорезом у формальдегід-агарозному гелі (1,2%), переносили на нейлонову мембрану і зшивали ультрафіолетовим світлом. Потім мембрану піддавали аналізу нозерн-блот спочатку з випадково активованою (32-міченою) кДНК миші MT-I, а потім з кДНК GAPDH щура. Доріжки з 1 по 3 вказують на рівні РНК у необроблених контрольних клітинах, клітинах, оброблених 3 год ZnSO 4 (50 мкМ) і CdSO 4 (15 мкМ). Доріжки 4-6 вказують на рівень РНК у необроблених клітинах, клітинах, оброблених протягом 3 годин ZnSO 4 (100 мкМ) і CdSO 4 (30 мкМ) після обробки 5-AzaC.
Повнорозмірне зображення
Геномний аналіз слідів показує, що жоден з активаторів транскрипції в клітинах лімфосаркоми не може зв'язуватися з промотором МТ-I in vivo
Аналіз слідів in vivo промотору MT-I з 5 'праймерами нижньої нитки до і після обробки 5-AzaC. Клітини лімфосаркоми до та після обробки 5-AzaC інкубували з 0,1% диметилсульфатом, як описано в Матеріали та методи. Геномну ДНК очищали і очищали піперидином. За допомогою LM-PCR нижній ланцюг проксимального промотору MT-I ампліфікували і розділяли на 6% гелі послідовності. G-драбину виявили за допомогою авторадіографії. N-гола G-драбина, C-контроль та обробка Cd2 + -15 мкМ CdSO4. Нормативні елементи MRE-b, MRE-c, MRE-d, MRE-e та MLTF/ARE перераховані поруч із G-драбиною. Стрілки (←) позначають C-залишки, захищені CdSO4, а зірочки (*) - гіперчутливі G-залишки. Доріжки з 1 по 3 представляють G-сходи в оголеній ДНК, контрольних та оброблених CdSO4 клітинах P1798, тоді як смуги 4 - 6 позначають смуги з клітин, оброблених 5-AzaC, протягом 72 годин. Відповідне розміщення нижньої стрілки на місці зв'язування MRE-c важко через усмішку гелю, особливо доріжки 6.
Повнорозмірне зображення
Фактори транскрипції, які регулюють як базальну, так і індуцибельну експресію гена МТ-1, активні в клітинах лімфосаркоми.
Тест на зсув електрофоретичної рухливості MTF-1, Spl та MLTF/ARE в екстракті клітин лімфоцитів S-100. a ) Екстракти S-100 (10 мкг білка) з контрольних клітин та клітин, оброблених ZnSO4 (50 мкМ протягом 3 годин), інкубували з 32 P-міченим MRE-d оліго в оптимальних умовах зв'язування та ДНК-білком. Комплекси розділяли на поліакриламідному (4% акриламід, акриламід: бісакриламід = 38, 7: 1, 3) гелі з 0,25 х ТВЕ в якості запущеного буфера. Доріжки 1 і 5 являють собою комплекси, утворені екстрактом з контрольних клітин і оброблених цинком клітин. Доріжки 2-4 вказують на контрольний екстракт, інкубований із 100-кратним молярним надлишком немечених MRE-s, MRE-d та Sp1 оліго. ( b Активність зв'язування ДНК MLTF/USF вимірювали за допомогою 32-міченого оліго MLTF/ARE з екстрактом, описаним у ( a ) і комплекси запускали на 6% акриламідному гелі з трис (40 мМ) -гліцином (267 мМ) в якості буфера. Доріжки 1 і 3 позначають комплекси, утворені з екстрактами з контрольних клітин і клітин, що зазнають дії цинку, а смуга 3 - контрольний екстракт, інкубований зі 100-кратним молярним надлишком E-box консенсусного оліго.
Повнорозмірне зображення
Промотор МТ-I не метилюється в батьківських клітинах (тимус миші), але метилюється в усіх послідовностях CpG у клітинах лімфосаркоми миші.
Картування сайту обмежувального ферменту ПЛР-ампліфікованого мишачого промотору MT-I зі специфічним ланцюгом праймером після бісульфітного перетворення хромосомної ДНК. Хромосомну ДНК виділяли з контрольних клітин та оброблених 2,5 мкМ M-AzaC (72 год) клітин P1798, а також з тимусу миші. Потім ці зразки обробляли бісульфітом, а верхній ланцюг промотору МТ-I ампліфікували специфічними для ланцюга праймерами вкладеними ПЛР, як описано в Матеріали та методи. Потім ампліфікований продукт (1 мкг) перетравлюють різними ферментами рестрикції, відокремлюють на 2% агарозному гелі з низькою температурою плавлення і фарбують бромідом етидію. ( a Доріжки 2-4 представляють Msp I, Apo I та Tsp509 I, що розщеплюють контрольну ДНК лімфосаркоми, відповідно. Подібним чином, смуги 6 - 8 позначають ампліфіковану ДНК з клітин, оброблених 5-AzaC, а смуги 10 - 12 вказують на ДНК тимусу, перетравлену тими ж ферментами рестрикції, що і контроль. Доріжки 1, 5 та 9 представляють продукт ПЛР із контрольної лімфосаркоми та тимусу, обробленої 5-AzaC, а смуга М вказує на 100 bp ДНК-сходи (New England Biolab). ( b ) Доріжки 1-4 представляють продукти, що перетравлюються ампліфікованою ДНК з контрольних клітин та клітин лімфоцитів, оброблених 5-AzaC.
Повнорозмірне зображення
( a ) Метильовані CpG-динуклеотиди в мишачому промоторі MT-I, ідентифіковані геномним секвенуванням бісульфіту в клітинах лімфосаркоми. ( b ) ПЛР-секвенування перетвореного та ампліфікованого бісульфітом ДНК верхнього ланцюга промотору MT-I з клітин лімфосаркоми до та після лікування 5-AzaC та з тимусу миші. ПЛР-ампліфікований верхній ланцюг гена MT-I піддавали ПЛР-секвенуванню з використанням фемтомолярного набору для секвенування ДНК (Promega) з тими самими праймерами, що використовувались у другому раунді вкладеної ПЛР, (а) тимусу, (b) контролю та (c) клітини лімфосаркоми, оброблені 5 -AzaC
Повнорозмірне зображення
Вестерн-блот-аналіз мРНК MT-I в клітинах, оброблених 5-AzaC, а потім вирощений у відсутність 5-AzaC. Клітини, оброблені 5-AzaC (+ 5-AzaC) і згодом вирощені в середовищі, що не містить ліків (± 5-AzaC), обробляли 50 мкМ ZnSO 4 протягом 3 годин. Загальну виділену РНК (30 мкг) з цих клітин піддавали Northern blot-аналізу з MT-I або GAPDH як зонд, як описано на малюнку 1. Доріжки 1 і 2 представляють РНК з необроблених або оброблених цинком клітин + 5-AzaC. смуги 3 і 4 позначають РНК з необроблених та оброблених цинком клітин ± 5-AzaC
Повнорозмірне зображення
обговорення
Показано, що деметилюючий агент, 5-AzaC, знищує ген MT-I у двох клітинних лініях тимоми, S-49 та W-7 (Compere та Palmiter, 1981). Однак ці дослідження не досліджували, чи здатні батьківські клітини (тимус) індукувати МТ у відповідь на важкі метали та чи обумовлена реактивація промотору МТ-I безпосереднім впливом 5-АзаС на промотор або деметилювання та подальша активація ген-специфічного фактора транскрипції. Якщо промотор МТ-I є гіперметильованим, природа місць метилювання в активному та неактивному станах не визначена. Жодне з цих досліджень не повідомляло далі, чи мовчання генів МТ шляхом метилювання промотором є характерною ознакою пухлин, похідних тимусу. Наші результати показують, що ген MT-I мовчить у клітинах лімфосаркоми, але не в тимусі через метилювання островів CpG в промоторі або в області, проксимальній до промотору. Також нещодавно ми спостерігали, що замовчування гена МТ-I внаслідок метилювання не обмежується лише пухлинами, похідними лімфоцитів (K Ghoshal і ST Jacob, неопубліковані дані). Ці спостереження дозволяють припустити, що на певному етапі розвитку пухлини промотор МТ-I стає сприйнятливим до метилювання ДНК метилтрансферазою (ДНК-МТаза). Невідомо, чому лише деякі гени, що містять острови CpG, специфічно метилюються в пухлинах.
Вражаючим спостереженням стала тривала реакція клітин P1798 на важкі метали, незважаючи на виведення 5-AzaC після початкового деметилювання та росту клітин протягом десяти разів удвічі. Ці дані підтверджують уявлення про те, що de novo метилаза не має високої активності в цих клітинах лімфосаркоми. Можливо, активність de novo метилази була тимчасово індукована на початковій стадії розвитку лімфосаркоми з тимусу та метильованого гена MT-I. Пізніше стан метилування гена було продовжено підтримуючою метилазою, яка використовує геміметильовану ДНК в якості субстрату (Szyf, 1996). Коли обидві нитки деметилюються після обробки 5-AzaC, підтримуюча метилаза не може метилювати ці CpG-динуклеотиди. Нещодавно було показано, що множинні форми ДНК-МТази генеруються в різних тканинах шляхом альтернативного сплайсингу (Deng and Szyf, 1998). Хоча функції цих варіантів поки не відомі, цілком ймовірно, що клітини P1798 експресують форму, яка каталізує підтримуюче метилювання, але не та, що виявляє активність метилази de novo.
$ config [ads_text16] не знайдено
Значно вищий метилювання, яке відбувається у багатьох клітинних лініях пухлини, здається, зумовлене вищою активністю ДНК-метилтрансферази (Szyf, 1996). Пряма роль DMA-МТази в розмноженні пухлини була показана надмірною експресією кДНК для цього білка, що призвела до трансформації клітин, шляхом експресії антисмислової РНК. Було б цікаво порівняти активність та рівень експресії цього ферменту в тимусі та лімфосаркомі. Ми також виміряли рівень експресії кількох генів супресорів пухлини, наприклад, pRb, p53, p16, які безшумні в різних пухлинах шляхом метилювання. Дивно, але всі три вони експресуються в клітинах лімфосаркоми (C Dong і ST Jacob, неопубліковані дані). У цьому контексті можна припустити, що інший ген супресора пухлини, який може бути специфічним для пухлин, що походять з Т-клітин, пригнічується в клітинах P1798 шляхом метилювання його промотору. В якості альтернативи, металлотіонеїн сам по собі або у поєднанні з іншим супресором пухлини може функціонувати як пригнічувач росту в цих ракових клітинах. Вивчення в цьому напрямку триває. Тим не менше, це дослідження остаточно продемонструвало, що гіперметилювання промотору МТ-I несе виключну відповідальність за його репресію в клітинах лімфосаркоми миші.
Матеріали і методи
Культура клітин, обробка 5-азацитидином та важкими металами
Клітини лімфосаркоми миші P1798 були подарунком доктора А. Е. Томпсона, Техаський університет, Галвастон, США. Ці клітини вирощували у середовищі RPMI 1640, що містить 25 мМ HEPES (рН 7,2), 2 мМ глутаміну, 2% бікарбонату натрію, 0,2 мкМ β-меркаптоетанолу та 5% плодової бичачої сироватки. Клітини щільністю 0,5 × 10 6 мл обробляли 2,5 мкМ 5-азацитидином (Sigma) протягом 72 - 90 год, поки клітини не поділялися принаймні один раз. Контрольні або оброблені 5-AzaC клітини при щільності 1 × 10 6/мл обробляли CdSO 4 (15 мкМ) або ZnSO 4 (50 мкМ) протягом 3 год.
Виділення загальної РНК та аналіз нозерн-блот
Загальну РНК виділили з 10 7 клітин методом гуанідиній тіоціанат-кислого фенолу (Chomczynski and Sacci, 1987). Тридцять мікрограмів загальної РНК відокремлювали гель-електрофорезом у формальдегід-агарозі (1,2%) і переносили на нейлонову мембрану, яку потім гібридизували з мишами з випадковим грунтуванням, кДНК MT-I, міченою α- 32 P-dCTP, або щурячим гліцеральдегідом зонд фосфатдегідрогенази (GAPDH) у буфері швидкої гібридизації (Amersham) відповідно до протоколу виробника.
Аналіз електрофоретичного переміщення рухливості (EMSA) трансактиваторів, які зв'язуються з мишачим промотором МТ-1
Діяльність факторів, що зв’язують ДНК, вимірювали в екстракті S-100, приготованому з клітин лімфосаркоми, згідно опублікованого протоколу (Ghoshal and Jacob, 1996). Для цього 10 мкг екстракту інкубували з 0,1 - 0,5 нг 32-мічених дезоксиолігонуклеотидів, мічених Р, в буфері, що містить 10 мМ HEPES (рН 7,9), 60 м M KCl, 5 м M MgCl 2, 0,5 м M DTT, 10% гліцерину та 1 мкг полі (dI-dC). Олігонуклеотиди маркуються шляхом кінцевого заповнення α- 32 P-dGTP та трьома іншими dNTP кленом. Активність MTF-1 та Sp 1 вимірювали за допомогою MRE-d оліго (Ghoshal et al., 1998Ghoshal et al., 1998). Для конкурентної EMSA екстракт попередньо інкубували зі 100-кратним молярним надлишком неміченого конкурента протягом 15 хв на льоду перед додаванням міченого оліго. Реакційну суміш інкубували на льоду протягом 30 хв, а ДНК-білковий комплекс відокремлювали електрофорезом у поліакриламідному (4% акриламідному) гелі. Послідовності верхнього ланцюга використовуваних дезоксиолігонуклеотидів є такими: (1) MRE-d оліго (для Sp 1 і MTF-1) 5′-G ATCC AGGGAGCTCT GCACTCCG CCCGAAAAGTA; (2) MRE-s оліго (для MTF-1) 5′-GATCCAGGGAGCTCTGCACACGGCCCGAAAAAGTA; (3) MLTF/ARE (для MLTF) 5′-GATCCGCGGGGCGCGTGACTATGCGTGGGCTGGA; (4) MLTF (для MLTF) 5′-CACCCGCACGTGCCTACACC.
Бісульфітне геномне секвенування промотору MT-I у клітинах лімфосаркоми для визначення залишків метильованого цитозину
Для послідовності бісульфітів промотору МТ-I у клітинах лімфосаркоми або тимусу миші ми дотримувались методу Clark et al. (1994), з деякими модифікаціями, щоб полегшити повне перетворення цитозинів в урацили, метилцитозини залишаються незмінними. ДНК виділяли з клітин лімфосаркоми та тимусу миші та денатурували (5 мкг) 0,3 М NaOH (свіжоприготований) при 37 ° С протягом 30 хв. Свіжоприготований розчин метабісульфіту натрію (2,35 М), що містить гідрохінон (0,04 М), додавали до денатурованої ДНК і двадцять разів циклізували в термоциклері при 50 ° С протягом 30 хв і 95 ° С протягом 2 хв. Оброблену бісульфітом ДНК знесолили за допомогою набору Wizard DNA Clean Up (Promega), десульфонували 50 мМ NaOH при 37 ° С протягом 30 хв, нейтралізували ацетатом натрію (pH 4,5) (0,2 М, кінцева концентрація) та очистили за допомогою Wizard Набір для очищення ДНК. Аликвоту перетвореної ДНК використовували для ампліфікації промотору МТ-I. Праймери, що використовуються для ампліфікації верхнього ланцюга гена MT-I, перетвореного бісульфітом, є наступними: Для першого раунду ПЛР (m = миша): mMTI-S1: 5′-TAGAGTAGATGGGTTAAGGTGAGTG; mMTI-A1: 5′-ATCCCCACTTAATATTCTAAAAACC. Для вкладеної ПЛР: mMTI-S2: 5′-AGGAGTAGAGAATAATGTTGAGATGAGT; mMTI-A2: 5′-CTTAAAAAACAACCTACCCTCTTTATAAT (температура відпалу, 60 ° C).
Для перевірки ефективності бісульфітної реакції ампліфіковану ДНК (500 п.н.) спочатку перетравлюють рестрикційними ферментами Apo I (G/C ↓ AATT ↑ A/T) і Tsp509 I (↓ AATT ↑), які можуть розщеплювати лише перетворене, але не непокрита ДНК. Сайти рестрикції для цих двох ферментів утворюються лише тоді, коли залишки С перетворюються на залишки Т. Завершення перетворення бісульфіту підтверджується повним перетравленням ампліфікованої ДНК Apo I або Tsp509 I. Далі ми секвенували продукти ПЛР з клітин лімфосаркоми та тимусу за допомогою системи секвенування fmol (Promega) вкладеними праймерами PCR, а також внутрішнім праймером 5 -TTGGGGAAAGTATTATAGGGATATGATG для верхньої нитки. У обробленій бісульфітом ДНК лише метильовані цитозини будуть секвенуватися як Cs, а перетворені неметильовані залишки C будуть секвенуватися як Ts. Геномне секвенування бісульфітів також проводили з хромосомною ДНК з клітин, оброблених 2,5 мкМ 5-AzaC протягом 72 год, які експресують МТ-1 у відповідь на важкі метали.
Аналіз геномного сліду in vivo промоторної області мишачого гена MT-I клітин лімфосаркоми до і після деметилювання 5-AzaC
Метилювання клітинної ДНК та вилучення ДНК in vivo описано Mueller and Wold (1989). Послідовність ДНК, що представляє інтерес, ампліфікувалась за допомогою лігування-опосередкованої ПЛР (LM-PCR) згідно з процедурою Meuller and Wold, модифікованою Ping et al. (1996). Коротко, процедура включає вплив клітин лімфосаркоми в живильному середовищі (RPMI) діметилсульфатом (1 мкл/мл) протягом 2 хв при кімнатній температурі з подальшим очищенням геномної ДНК. Потім метилированную ДНК розщеплювали в положеннях метилгуаніну з піперидином (10%) при 90 ° С протягом 30 хв. Потім очищену, розщеплену ДНК (2 мкг) піддавали LM-PCR для аналізу слідів на послідовностях MRE та MLTF/ARE за допомогою специфічних праймерів мишачого MT-I, як описано раніше (Mueller and Wold, 1989). Праймери, що використовуються для LM-PCR нижньої нитки, є наступними: (1) 5′-GAGTTCTCGTAAACTCCAGAGCAGC; (2) 5′-CAGAGCAGCGATAGGCCGTAATATC; (3) 5′-GATAGGCCGTAATATCGGGGAAAGCAC.
Дякую
Автори вдячні Обрі Томпсону та Річарду Пальмітеру за надання клітин лімфосаркоми миші Р1798 та мінігену миші MT-I відповідно. Цю роботу підтримали, частково, грант USPHS CA61321 Ст. Джейкобу та Інституційний грант ACS K Ghoshal.