Резюме

Анотація

Вступ

Клітини нервового гребеня (NC) виникають під час нейруляції хребетних між епідермісом та нервовим епітелієм. Вони широко розмножуються і мігрують по всьому розвивається ембріону і породжують вражаюче різноманіття типів клітин нащадків, включаючи кістки/хрящі, черепно-лицьовий скелет, сенсорні нерви, клітини Шванна, меланоцити, клітини гладких м’язів, кишкові нейрони, вегетативні нейрони, хромафінові клітини, клітини серцевої перегородки, зуби та клітини надниркових залоз/щитовидної залози 6. Отже, клітини NC є привабливим типом клітин для поля стовбурових клітин і важливі для моделювання різноманітних захворювань, таких як хвороба Гіршпрунга 7, сімейна диссавтономія 8, як а також ракові пухлини, такі як нейробластома 9. Крім того, вони пропонують можливість вивчення аспектів людського ембріонального розвитку in vitro.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Підготовка культуральних середовищ, покритих пластин та підтримка hPSC

Підготовка 1.1 Носій

Примітка: усі фільтруючі середовища для стерилізації зберігаються при температурі 4 ° C у темряві до 2 тижнів. Номери назв реагентів для компанії та каталогу вказані в Таблиця матеріалів.

  1. DMEM/10% FBS: об'єднайте 885 мл DMEM, 100 мл FBS, 10 мл пеніциліну/стрептоміцину та 5 мл L-глутаміну.
  2. HES-середовище: об'єднайте 800 мл DMEM/F12, 200 мл KSR, 5 мл L-глутаміну, 5 мл пеніциліну/стрептоміцину, 10 мл мінімального розчину незамінних амінокислот MEM, 1 мл β-меркаптоетанолу. Додайте 10 нг/мл FGF-2 після фільтрування середовища.
    УВАГА: β-меркаптоетанол токсичний, уникайте вдихання, потрапляння всередину та контакту зі шкірою.
  3. KSR-диференційоване середовище: об'єднайте 820 мл DMK-нокауту, 150 мл KSR, 10 мл L-глутаміну, 10 мл пеніциліну/стрептоміцину, 10 мл MEM мінімального розчину незамінних амінокислот та 1 мл β-меркаптоетанолу.
  4. N2-диференційоване середовище: Розчиніть 12 г порошку в 980 мл DMEM/F12 dH 2 O, додайте 1,55 г глюкози, 2 г бікарбонату натрію та 100 мг АРО трансферину людини. Змішайте 2 мл dH2O з 25 мг людського інсуліну та 40 мкл 1 N NaOH, додайте розчинений розчин до середовища. Додайте 100 мкл путресцину дигідрохлориду, 60 мкл селеніту, 100 мкл прогестерону і доведіть об’єм до 1 літра dH 2 O.

1.2 Покриття культуральних пластин

1.3 Технічне обслуговування hPSC

Примітка: hPSC підтримують у 0,1% желатині та мітотично інактивованих ембріональних фібробластах миші (MEFS) у середовищі HES, доповненому 10 нг/мл FGF-2, як описано раніше 10,12. Клітини слід ділити кожні 6-8 днів.

  1. Покрийте 10-сантиметрову тарілку 8 мл 0,1% желатину (у 1x PBS без магнію або кальцію) при кімнатній температурі протягом 5 хв.
  2. Швидко заморожені MEF розморожуйте на водяній бані при 37 ° C. Додайте 1 мільйон MEF до 10 мл DMEM/10% FBS.
  3. Аспіруйте желатин і розпластуйте клітини. Інкубуйте при температурі 37 ° C щонайменше 6 годин.
  4. Відсмоктуйте DMEM/10% FBS з підготовленої пластинки MEF, промийте планшет 1 раз PBS і додайте 10 мл HES-середовища з 10 мМ дигідрохлориду Y-27632. Дайте середовищу нагрітися до 37 ° C протягом 20 хв.
    Примітка: Витяжка з ламінарним потоком із вбудованим мікроскопом використовується для ручного поділу hPSC. Однак клітини можна проходити за допомогою відповідних альтернативних методів.
  5. Під витяжкою з ламінарним потоком із вбудованим мікроскопом відокремте окремі колонії за допомогою мобільного крана та дайте їм можливість плавати.
  6. Використовуйте шприц об’ємом 1 мл для аспірації плавучих колоній і відправляйте їх на прохолодну, теплу тарілку MEF. Перенесіть приблизно чверть клітин на нову страву. Інкубуйте при температурі 37 ° C.
  7. Щодня годуйте клітини свіжим середовищем HES.

2. Покриття hPSC для диференціації

Примітка: hPSC повинні ділитися або висіватися для диференціації, коли колонії великі, але все ще мають гострі краї з якомога меншою кількістю клітин, які диференціюються на своїх кордонах (див. Малюнок 1B). Коли клітини утримуються за допомогою ручного проходу, колонії повинні бути досить великими, щоб їх було легко побачити оком. Щоб отримати правильне відчуття для цього моменту часу, ви можете тримати окрему тарілку HPSC протягом двох тижнів без проходу і спостерігати, як клітини досягають і проходять ідеальний момент часу для проходження/диференціації.

3. Індукція нейрональної диференціації

Примітка: Диференціацію можна розпочати (день 0), коли клітини зливаються на 90-100% (див Малюнок 1С), зазвичай наступного дня. Якщо точного злиття не досягнуто, однак клітини можна годувати HES-середовищем щодня, поки вони не будуть готові до диференціації. Як варіант, початкову кількість засіяних клітин можна збільшити.

  1. У день від 0 до 3 щодня годуйте клітини щодня 10 мл/10 см KSR-диференційованого середовища, що містить 0,1 мкМ LDN193189 і 10 M SB431542.
  2. На 4 і 5 день живлять клітини 75% середовищем диференціювання KSR та 25% середовищем диференціювання N2, обидва містять LDN193189 та SB431542.
  3. На 6 та 7 день годують клітини 50% середовищем диференціювання KSR та 50% середовищем диференціювання N2, обидва містять LDN193189 та SB431542.
  4. На 8 і 9 день живлять клітини 25% середовищем для диференціювання KSR та 75% середовищем для диференціації N2, обидва містять LDN193189 та SB431542.
  5. На 9 та 10 день готують посуд з PO/Lam/FN, як зазначено у пункті 1.2.2, для заміни клітин на 11 день.
  6. На 10 день живлять клітини з N2-диференційованим середовищем, що містить LDN193189 та SB431542.

4. Заміна в краплі за технічними характеристиками ЧПУ

5. Флуоресценція сортування активованих клітин (FACS) NC клітин

Примітка: Підготовка клітин до FACS вимагає приблизно 2 годин.

6. Заміна класифікованих комірок, обслуговування та розширення NC

Примітка: відсортовані клітини FACS необхідно проводити з особливою обережністю, щоб забезпечити оптимальне виживання. Тримайте їх на льоду до тих пір, поки не пересадите. Не трясіть і не піпетуйте сильно. Клітини можна ресуспендувати, приводячи в дію трубку.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

гребеня

Рисунок 2. Порівняльна ідентифікація клітин нейронного гребеня клітин, отриманих за протоколом MS5-R-NC або R-NC. В обох протоколах клітини проходять через нейрональний розетковий стан. Сортовані NC-клітини виявляються ідентичними за морфологією та за експресією NC-маркерів, таких як HNK-1 та AP-2. NC-клітини є нестин-позитивними, що свідчить про те, що вони є клітинами-попередниками. Шкала: 200 м. Всі флуоресцентні зображення були забарвлені для DAPI. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Для всіх застосувань у галузі HPSC критично важливо мати доступні точні, відтворювані, визначені та конкретні протоколи диференціації in vitro. У цьому звіті ми показуємо адаптацію встановленого протоколу in vitro щодо диференціації для виведення клітин R-NC з hPSC. Протокол, про який повідомляється, виробляє ті самі клітини, що і раніше, 10 при більш визначених умовах вирощування та коротших часових рамках. Цей протокол може бути використаний для генерування клітин R-NC для захворювань людини, що вражають клітини лінії Північної Кароліни, для досліджень сполук, токсикологічних тестів та розробки протоколів диференціації, націлених на типи клітин, похідних від лінії NC.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не мають конфлікту інтересів для розголошення.