- реферат
- мета:
- методи:
- результати:
- висновок:
- вступ
- результат
- Етанол і дієта з високим вмістом жирів посилюють порушення функції печінки
- Гістологія печінки експериментальних тварин
- Експресія альфа-, бета- та дельта-білків C/EBP у мишей C57BL/6J (B6) з/без етанолу та без/з високим вмістом жиру
- Експресія білка C/EBP альфа, бета та дельта в клітинах HepG2 з/без етанолу
- Експресія білка дельта C/EBP в клітинах HepG2 з/без олеїнової кислоти
- Експресія білка Delta C/EBP у клітинах HepG2, інкубованих з етанолом та/або без олеїнової кислоти
- обговорення
- Внесок автора
реферат
Алкоголь, який переважно метаболізується в печінці, є основним токсикантом у печінці, який легко індукує стеатоз печінки. Експресія зв'язуючого білка підсилювача CCAAT (C/EBP), особливо дельта-сорту C/EBP, підвищується на ранній фазі адипогенезу. Однак роль дельта С/ЕВР у індукованому етанолом гепатостеатозі незрозуміла.
методи:
Самців мишей C57BL/6J випадковим чином розподіляли на одну з чотирьох груп: контрольну групу, перорально введену етанольну групу (4 г етанолу/кг маси тіла) (EtOH), групу з високим вмістом жиру (HF) та групу EtOH + HF група. Мишей забивали через 5 або 10 тижнів для різних вимірювань. Вплив етанолу in vitro на експресію альфа-, бета- та дельта-експресії C/EBP вивчали в клітинах HepG2.
результати:
До 5 тижня експресія дельта C/EBP у печінці та бета-білках (2,3-кратна та 1,4-кратна відповідно) суттєво збільшилася при обробці етанолом, який потім повернувся до контрольних рівнів до 10 тижня. І навпаки, експресія C/EBP зросла. альфа не був очевидний до 10 тижня. Дослідження in vitro показало, що дельта-експресія дельта C/EBP значно збільшилася через 24 години, але не через 48 чи 72 години. Експресія C/EBP бета була найвищою через 48 годин, тоді як експресія альфа C/EBP була найвищою через 72 години. Ми також виявили, що низькі концентрації етанолу та олеїнової кислоти збільшують експресію дельта C/EBP у клітинах HepG2.
висновок:
Дельта-експресія C/EBP відіграє важливу роль на ранній фазі індукованого етанолом гепатостеатозу у мишей та клітин HepG2, оброблених етанолом. Крім того, EtOH + HF збільшує експресію дельта C/EBP у клітинах HepG2. Таким чином, дельта C/EBP може бути терапевтичною мішенню при алкогольному гепатостеатозі.
Гостре або хронічне вживання алкоголю може спричинити серйозне пошкодження печінки 1. Відомо, що алкоголь погіршує окислення жиру та стимулює ліпогенез печінки 2, 3. Тому вживання алкоголю може призвести до розвитку стеатозу печінки. Більшість досліджень алкогольного стеатозу печінки зосереджені на здатності етанолу змінювати окисно-відновний стан у печінці та інгібувати окислення жирних кислот 3, 4. Дійсно, попередні дослідження показали пригнічення деяких ферментів, що беруть участь у окисленні жирних кислот та індукції ліпогенних ферментів у тварин, що харчуються етанолом 2, 5. Встановлено, що синтез жирних кислот De novo в печінці збільшується за допомогою етанолу у взаємодії з індукцією адипогенних ферментів, включаючи активований проліфератором пероксисоми рецептор альфа (PPAR альфа) та/або регулюючий елемент стеролу білок 1 (SREBP-1). ) 2, 6. Однак механізми, за допомогою яких етанол викликає стеатоз, численні та складні.
Білки, що зв'язують підсилювач CCAAT (C/EBP), є сімейством основних факторів транскрипції лейцинової застібки-блискавки, що беруть участь у регуляції диференціації клітин та функцій 7, 8, 9. Описано шість представників сімейства C/EBP, включаючи альфа, бета, гамма, дельта, епсилон та зета 10 C/EBP. C/EBP альфа, бета та дельта є важливими факторами транскрипції при диференціації жиру. C/EBP можуть впливати на адипогенез, регулюючи та координуючи каскад факторів транскрипції, які разом призводять до утворення диференційованого стану 11. Наприклад, було показано, що бета та дельта C/EBP експресуються на початку адипогенезу, тоді як альфа C/EBP експресується значно пізніше 12, 13. Показано, що життєво важлива роль бета та дельта C/EBP в адипогенезі порушує обидва гени, перешкоджаючи нормальному розвитку жирової тканини 14. Крім того, дельта-C/EBP-шумозаглушення погіршує експресію фактора диференціації адипоцитів 49 (fad49), який регулюється в адипогенезі і, схоже, відіграє ключову роль на початку процесу. .
McKnight та ін. 16 показали, що сам по собі дельта C/EBP має мінімальну адипогенну активність, і дельта C/EBP бета та C/EBP відіграють важливу роль у стимулюванні експресії C/EBP альфа та PPAR-гамми. Лай та ін. 17 показали, що індукція дельта-експресії C/EBP тимчасово активує транскрипцію PPAR гамма-2, яка бере участь в адіопоцитоподібному ліпогенезі в клітинах HepG2. Часовий профіль експресії цих трьох ізоформ C/EBP під час диференціації жиру може відображати основи регуляторного каскаду, який контролює процес диференціації кінцевих клітин 18 .
Попередні дослідження вивчали вплив етанолу на C/EBP у тварин та клітинних культурах, але результати суперечливі 10, 19, 20. Крім того, мало чи взагалі немає інформації про вплив етанолу на дельта С/ЕВР. У цьому дослідженні ми проводили експерименти in vivo та in vitro для дослідження змін дельта-експресії дельта С/ЕВР при індукованому етанолом гепатостеатозі. Ми висунули гіпотезу, що дельта C/EBP є важливим фактором транскрипції при гепатостеатозі, спричиненому етанолом.
результат
Етанол і дієта з високим вмістом жирів посилюють порушення функції печінки
Після 5 тижнів лікування рівні AST і ALT у сироватці крові були значно вищими у мишей у групах EtOH, HF та EtOH + HF, ніж у контрольній групі (P
Гістопатологічні зміни печінки у мишей C57BL/6J. (A) 5-тижневе лікування; печінка контрольних мишей (контроль), мишам, яким дають етанол (EtOH), дієтичним мишам з високим вмістом жиру (HF) або етанолу, даному в поєднанні з дієтою з високим вмістом жиру (EtOH + HF). (B) 10-тижневе лікування, фарбування печінки контрольних мишей (контроль), мишей, яким вводили етанол (EtOH), мишей з високим вмістом жиру (HF) або етанолом, які вводили в комбінації з мишами з високим вмістом жиру (EtOH + HF) (HE), × 200).
Повнорозмірне зображення
Експресія альфа-, бета- та дельта-білків C/EBP у мишей C57BL/6J (B6) з/без етанолу та без/з високим вмістом жиру
Щоб визначити, чи беруть участь C/EBP у прогресуванні індукованого етанолом стеатозу печінки, ми визначили експресію альфа, бета та дельта C/EBP у печінці миші після обробки етанолом, з дієтою HF або без неї, протягом 5 тижнів та 10 тижнів . Після 5 тижнів лікування експресія дельта C/EBP у печінці значно збільшилась (у 2,3 рази) у мишей, оброблених етанолом, порівняно з експресією у контрольних мишей. Крім того, експресія дельта-печінки C/EBP у мишей, які отримували EtOH + HF, була вищою, ніж експресія у мишей, які отримували або лише EtOH, або HF. Однак після 10 тижнів лікування експресія печінкової дельти C/EBP у мишей, оброблених EtOH, HF та EtOH + HF, була відновлена для контрольних мишей (Фігура 2А).
Експресія білка дельта, бета та альфа-підсилювача білка CCAAT (C/EBP) дельта, бета та альфа у мишей C57BL/6J, перорально оброблених етанолом (4 г/кг маси тіла; EtOH) з дієтою з високим вмістом жиру (HF) або без неї 5 або 10 тижнів. Верхні панелі - вестерн-плямами дельти C/EBP (A), бета (B) та альфа (C). Денситометрична кількісна оцінка рівнів білка (середнє значення ± SD, n = 3-4); значення, що не мають спільної букви, суттєво відрізняються (P і P> 0,05, b P e P
Експресія білка дельта, бета та альфа-підсилювача білка CCAAT (C/EBP) у клітинах HepG2, інкубованих з етанолом. Клітини HepG2 обробляли різними концентраціями етанолу (0, 10, 100, 200 або 400 ммоль/л) протягом 24 годин. Верхні панелі - вестерн-плями дельти C/EBP (A), бета (B) та альфа (C). Денситометрична кількісна оцінка рівнів білка (середнє значення ± SD). n = 3-4. a P> 0, 05, b P
Експресія білка дельта, бета та альфа-підсилювача білка CCAAT (C/EBP) у клітинах HepG2, інкубованих з/без етанолу. Клітини HepG2 обробляли 10 ммоль/л етанолу протягом 24, 48 та 72 годин. Верхні панелі - вестерн-плями дельти C/EBP, бета та альфа. Денситометрична кількісна оцінка рівнів білка (середнє значення ± SD, n = 3-4); значення, що не мають спільної букви, суттєво відрізняються (P і P> 0,05, b P
Експресія білка CCAAT, що посилює зв'язуючий білок (C/EBP) у клітинах HepG2, інкубованих з олеїновою кислотою. Клітини HepG2 обробляли різними концентраціями олеїнової кислоти (0, 25, 50, 100 або 200 мкмоль/л) протягом 72 годин. Верхні панелі - вестерн-плямами дельти C/EBP. Денситометрична кількісна оцінка рівнів білка (середнє значення ± SD, n = 4); значення, що не мають спільної букви, суттєво відрізняються. b P c P
Експресія білка CCAAT, що посилює зв'язуючий білок (C/EBP) дельта в клітинах HepG2. Клітини HepG2 обробляли 25 мкмоль/л олеїнової кислоти, 10 ммоль/л етанолу або 25 мкмоль/л олеїнової кислоти в комбінації з 10 ммоль/л етанолу протягом 24-72 годин. Експресія білка, показана на верхніх панелях, є дельта C/EBP. Денситометрична кількісна оцінка рівнів білка (середнє значення ± SD, n = 4); значення, що не мають спільної букви, суттєво відрізняються. b P c P f P 24. C/EBP альфа, бета та дельта є важливими факторами транскрипції при диференціації жиру. Рання експресія дельта C/EBP необхідна для ефективної індукції C/EBP альфа та PPAR гамма 25. Однак мало відомо про те, чи беруть участь C/EBP у прогресуванні алкогольного гепатостеатозу. У цьому дослідженні ми обробляли мишей етанолом для індукування алкогольного гепатостеатозу і виявили, що експресія дельта C/EBP була підвищена на ранніх стадіях гепатостеатозу, що свідчить про те, що дельта C/EBP відіграє важливу роль у прогресуванні алкогольного гепатостеатозу.
У цьому дослідженні ми показали, що введення етанолу спричинило пошкодження печінки, про що свідчать підвищені рівні АСТ і АЛТ у сироватці крові та патологічні зміни, які показали, що ліпіди почали накопичуватися в гепатоцитах мишей, оброблених етанолом, протягом 5 тижнів. У мишей, які отримували етанол протягом 10 тижнів, розвинувся більш важкий гепатостеатоз, ніж у тварин, які отримували лікування протягом 5 тижнів. ALT був набагато нижчим у мишей, які отримували EtOH + HF, ніж у мишей, які отримували лише етанол. Ми припускаємо, що дієта з високим вмістом жиру може захистити від пошкодження печінки, спричиненого етанолом, що може бути наслідком зменшення всмоктування етанолу в шлунку. Більш серйозні гепатостеатотичні зміни в печінці мишей, які отримували EtOH + HF, ймовірно, були зумовлені комбінованим ефектом EtOH та HF, як повідомлялося в цьому дослідженні, збільшенням експресії дельта C/EBP та, можливо, інших C/EBP.
Ми показали, що дельта C/EBP брав участь у прогресуванні індукованого етанолом стеатозу печінки і що його експресія була дельтою більшою, ніж експресія бета C/EBP на 5 тижні (збільшення в 2, 3 та 1, 4 рази), тоді як експресія Альфа C/EBP не виявлявся до 10 тижня. Цікаво, що експресія печінки C/EBP бета та дельта повернулася до контрольних рівнів до 10 тижня. Ці результати дозволяють припустити, що дельта C/EBP може відігравати важливу роль на ранній фазі, але не на пізній фазі гепатостеатозу, в цій моделі миші. І навпаки, C/EBP альфа може брати участь у пізній фазі стеатозу печінки у мишей.
У клітинах HepG2, інкубованих з олеїновою кислотою, ми спостерігали, що експресія дельта C/EBP була значно збільшена. Дані підтверджують думку про те, що дельта C/EBP бере участь у адипогенній диференціації 25. Це дослідження in vitro показало, що низька концентрація (10 ммоль/л) етанолу не тільки збільшує дельта-експресію дельта-С/ЕВР, але також є синергічною з олеїновою кислотою, сприяючи експресії дельта-С/ЕВР у клітинах HepG2. Дивно, але експресія альфа, бета та дельта C/EBP у клітинах HepG2 була відновлена до рівня, подібного до рівня контролю при більш високих концентраціях етанолу (200 та 400 ммоль/л). Можливо, що низькі та високі концентрації етанолу можуть впливати на експресію C/EBP різними механізмами. Детальні механізми, за допомогою яких дельта C/EBP координується з іншими C/EBP для опосередкування інших адипогенних факторів, таких як PPAR, адипонектин та SREBP, ще не вивчені.
На закінчення ми продемонстрували збільшення дельта-експресії дельта C/EBP у відносно ранній фазі індукованого етанолом гепатостеатозу у мишей. Наше дослідження in vitro також показує, що етанол та олеїнова кислота збільшують експресію дельта C/EBP у клітинах HepG2. Ці результати свідчать про те, що пригнічення дельта С/ЕВР є потенційною терапевтичною мішенню при алкогольному гепатостеатозі.
Внесок автора
Дослідження було розроблено Miao-lin HU та Yu-hsuan CHEN; Ю-хсуань ЧЕН, Чіх-мін ЯН та Ши-пей ЧАНГ провели експеримент та проаналізували дані; Газету написали Мяо-лін ХУ та Ю-сюань ЧЕН.