реферат
МЕТА: У цьому дослідженні ми розглянули питання про те, чи існує депо-специфічна експресія клітинного інгібітора апоптозу білка-2 (cIAP2) у дитячому віці та чи змінюється відносна експресія з віком паралельно із збільшенням ризику ожиріння вісцеральної системи.
Предмети: Парні зразки жирової тканини людини (ОМ) та підшкірної (СК) були отримані у 23 пацієнтів (12 дітей та 11 дорослих).
МЕТОД: Рівень MRNA cIAP2 визначали за допомогою ланцюгової реакції полімеразної зворотної транскрипції (RT-PCR) та експресії білка, підтвердженої вестерн-блот. Індекси апоптозу визначали шляхом опосередкованого дезоксинуклеотидилтрансферазою мічення dUTP-флуоресцеїну нікелевого кінця (TUNEL).
РЕЗУЛЬТАТИ: мРНК cIAP2 була в 1,5 рази вищою в ОМ порівняно з жировою тканиною СК (ОМ> СК у 20 з 23 суб'єктів; Р СК у дев'яти з 10 суб'єктів, Р 1
Ожиріння характеризується збільшенням маси жирової тканини. Вага жиру в організмі, особливо накопичення вісцерального жиру, тісно пов’язана з резистентністю до інсуліну, серцево-судинними захворюваннями, гіпертонічною хворобою та іншими основними метаболічними порушеннями. 2 Це наголошувало на важливості виявлення генетичних факторів, що регулюють не тільки жир, а й розподіл жиру.
Відомо, що сальникові (ОМ) і підшкірні (СК) адипоцити відрізняються різними метаболічними властивостями, що регулюють обсяг жирових клітин. На реплікацію, диференціацію та апоптотичну реакцію жирових клітин людини впливає анатомічна область. 5, 6. Таким чином, розподіл жирової тканини може бути результатом різниці в регуляції цих процесів, характерної для певної ділянки. Нещодавно було показано, що регіональні характеристики можуть бути пов’язані зі специфічними для місцевості відмінностями в експресії генів, що кодують важливі функціональні білки. Наприклад, експресія лептину та PPAR γ є вищою у СК, ніж жирова тканина ОМ. На відміну від цього, експресія рецепторів інсуліну (Ex 11 -) вища в ОМ порівняно з жировою тканиною СК. 9
Клітинний інгібітор білка апоптозу-2 (cIAP2) є членом сімейства інгібіторів білків апоптозу (ІАП), який бере участь у регуляції апоптозу під час проліферації та диференціації клітин. Роль ІАП в жировій тканині людини незрозуміла, але все більша кількість доказів свідчить про те, що вона може відігравати роль у регулюванні розподілу жиру в організмі шляхом модуляції апоптозу жирових клітин. Один з довідок показав, що диференційована залежність експресії інгібуючого білка апоптозу нейронів (NAIP) у жирових клітинах 3T3-L1 може корелювати з розвитком стійкості адипоцитів до апоптозу. Два інші дослідження повідомляють, що мРНК cIAP2 експресується депо-специфічно для адипоцитів дорослої людини. 14, 15
Досі дослідження різниці в експресії генів зосереджувались на дорослих. Дуже мало відомо про експресію генів у місці виникнення в жировій тканині у дітей. Оскільки існують вікові відмінності в жировій тканині людини з точки зору ваги та розподілу, ми розглянули питання, чи існує депо-специфічна експресія cIAP2 у дитячому віці, і якщо так, то якщо відносна експресія змінюється з віком паралельно зі збільшенням доза. ризик ожиріння вісцерального апарату. Тому в цьому дослідженні ми порівняли рівні експресії cIAP2 як на рівні мРНК, так і на рівні білка в жировій тканині ОМ та СК у дітей та дорослих. Крім того, ми вивчили взаємозв'язок між рівнем експресії cIAP2 та рівнем апоптозу адипоцитів, індексом маси тіла (ІМТ) та статтю.
методи
Суб'єкти та вибірки
Препарат РНК та RT-PCR
Рівні мРНК CIAP2 визначали у всіх суб'єктів, у яких була загальна РНК як з жирової тканини SC, так і з ОМ. Загальну РНК готували з використанням реагенту TRIzol (Invitrogen life technologies, Каліфорнія, США) згідно з протоколом виробника. Кількісно визначали РНК спектрофотометрично. Цілісність РНК перевіряли фарбуванням смуг рибосомальних РНК бромідом етидію з використанням 1% агарозного гелю. Отриману РНК зберігали при -70 ° С до використання.
RT-PCR проводили для аналізу мРНК cIAP2. Загальну РНК (0,5 ∼ 1 мкг) транскрибували зворотно протягом 1 год при 42 ° C у 20 мкл буфера, що містить 200 U MMLV зворотної транскриптази, 0,5 мкг Oligo d (T) 16, 0,5 ммоль/л dNTP Додатки ДНК (кДНК) денатурували протягом 5 хвилин при 95 ° C, і 5 мкл кДНК з кожного зразка використовували для подальшої ампліфікації ПЛР в кінцевому обсязі 50 мкл буфера, що містить 2,5 U Taq ДНК-полімерази. 2 ммоль/л. dNTP, 2,5 ммоль/л MgCl2 і 0,4 мкмоль/л кожен праймер. Умови ПЛР становили 95 ° С протягом 5 хвилин, потім 30 циклів при 94 ° С протягом 30 с, 60 ° С протягом 45 с і 72 ° С протягом 1 хвилини, і, нарешті, 72 ° С продовження протягом ще 10 хвилин. RT-реагенти постачала компанія Promega Corp. (Медісон, США). ПЛР-реагенти були від компанії Roche (Мангейм, Німеччина). Два набори праймерів використовували одночасно в цій напівкількісній RT-PCR (Таблиця 1). Різна кількість циклів ПЛР була використана для того, щоб переконатись, що ампліфікація кДНК як cIAP2, так і β-актину знаходиться в експоненціальному діапазоні. Праймери для β-актину додавали в шостому раунді кожної ампліфікації ПЛР.
Стіл в натуральну величину
Після ампліфікації 10 мкл суміші поділяли на 1,5% агарозному гелі, забарвленому бромідом етидію. Гелі візуалізували під ультрафіолетовим світлом, вимірювали щільність, а також співвідношення cIAP2 до β-актину, використовуючи програмне забезпечення Quantitation, версія 4 Windows та Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США).
Виділення білка та Вестерн-блот-аналіз
Виявлення апоптозу
Апоптотичні адипоцити в 15 парних зразках були виявлені за допомогою термінального дезоксинуклеотидилтрансферазового мічення dUTP-флуоресцеїну на нікелі (TUNEL) відповідно до протоколу виробника. Апоптотичні індекси були отримані підрахунком 200 адипоцитів принаймні в чотирьох полях зору під світловим мікроскопом.
Статистичний аналіз
Дані аналізували за допомогою статистичного пакету соціальних наук (SPSS) і присвоювали значення Р менше 0,05. Оскільки експресія cIAP2 у жировій тканині зазвичай не розподілялася, вони представлені у тексті та таблиці як медіана (міжквартильний діапазон). Для порівняння відмінностей експресії між СК та ОМ використовували підписаний тест Уілкоксона; Тест Манна-Уітні був використаний для порівняння специфічних для депо відмінностей між дітьми та дорослими. Кореляції розраховували за допомогою тесту коефіцієнта кореляції Спірмена.
результат
Порівняльні порівняння експресії мРНК cIAP2 із жирової тканини SC та OM визначали кількісно за допомогою RT-PCR, як показано на малюнку 1а. Були помітні відмінності в рівні експресії між особами, особливо в ОМ (рис. 1b). Тим не менш, існувала значна депо-специфічна різниця у рівні експресії мРНК cIAP2 (табл. 2). мРНК cIAP2 була в 1,5 рази вищою в ОМ порівняно з жировою тканиною СК (ОМ> СК у 20 з 23 суб'єктів; P 
Депо-специфічні відмінності у експресії мРНК cIAP2. а) Приклад аналізу агарозного гелю після RT-PCR парних зразків жирової тканини SC та OM від п’яти осіб. (б) Точкові графіки показують, що експресія мРНК cIAP2 в SC та OM жирова у всіх особин. Горизонтальні смуги позначають медіану.
Повнорозмірне зображення
Стіл в натуральну величину
Вестерн-блот показані на малюнку 2. Відповідно до експресії мРНК, рівні білка cIAP2 були вищими в ОМ порівняно з СК (ОМ> СК у дев'яти з 10 суб'єктів, Р
Депо-специфічні відмінності у експресії білка cIAP2. (а) Приклад імуноблотів білків cIAP2 із жирової тканини SC та OM чотирьох осіб. (b) Розсіяні графіки демонструють експресію білка cIAP2 в жирових клітинах SC та OM 10 особин. Горизонтальні смуги позначають медіану.
Повнорозмірне зображення
Імуногістохімічний аналіз не показав різниці між СК та ОМ в апоптотичних індексах адипоцитів (апоптотичні індекси 14, які продемонстрували вищу експресію мРНК cIAP2 в ОМ, ніж у адипоцитах СК дорослих. Однак їх дослідження було зосереджене лише на рівні мРНК, оскільки експресія мРНК не завжди відображаючи експресію білка або концентрацію повністю обробленого білка, ми продовжили спостереження, підтвердивши, що основна різниця між жировою тканиною ОМ та СК також відбувається на рівні білка.
Спочатку CIAP2 був ідентифікований як білок, який зв'язується з сигнальним комплексом рецептора TNF, припускаючи, що він може брати участь у регуляції сигналізації TNFα. Надмірна експресія білка cIAP2 людини може придушити загибель клітин, спричинену різними стимулами. Порівняно з ізольованими адипоцитами людини, преадипоцити, культивовані в сироватковому середовищі, мають більш високий рівень мРНК cIAP2, а також меншу сприйнятливість до індукованого TNFα апоптозу. 14, 15, 17 Отже, експресія cIAP2 в жировій тканині SC та OM може відображати специфічну для депо сприйнятливість до апоптозу і, отже, втрату або відкладення жирової тканини.
Ріст і розподіл жирової тканини людини сильно залежить від віку та статі. Накопичення специфічних для клітин жирових клітин у ранньому віці може сприяти відкладенню депо-специфічних запасів жиру в більш пізньому віці. Багато спостережень свідчать про те, що ожиріння програмується під час критичних періодів розвитку, наприклад, ожиріння в ранньому дитинстві погано розвивається в зрілому віці, тоді як ожиріння в підлітковому віці збільшує ризик стійкого ожиріння та його ускладнень. У цьому дослідженні ми порівняли модель експресії cIAP2 у дітей з дорослими. Результати показали, що специфічна для депо різниця у експресії мРНК cIAP2 була послідовною у дітей та дорослих. Експресія мРНК CIAP2 не показала значних вікових змін. Також не було значущих зв'язків між експресією мРНК cIAP2 та ІМТ або статтю. Цікаво, що різниця між ОМ та СК була більш вираженою у дітей. Оскільки в дитинстві вісцеральна жирова тканина обмежена, як правило, більша експресія у дітей може відображати лише чистий приріст вісцеральної жирової тканини під час росту і, отже, меншу сприйнятливість до апоптозу. Ця можливість підтверджується спостереженням, що рівні експресії NIAP у підшкірних черевних преадипоцитах в 3-5 разів вищі після втрати ваги, що сприяє відновленню ваги. 20
У цьому дослідженні ми не змогли продемонструвати жодної різниці в базальній швидкості апоптозу між адипоцитами з двох депо. Ймовірним поясненням є те, що базальні апоптотичні індекси були занадто низькими для точної кількісної оцінки та порівняння. Ця думка підтверджується тим фактом, що Prins et al. 17 показали, що базальний апоптотичний індекс жирових клітин, культивованих у сироватковому середовищі, був дуже низьким, незалежно від використовуваного методу. Однак ми не можемо виключити, що використаний метод є надто нечутливим, щоб продемонструвати різницю в показниках апоптозу між двома ділянками жирової тканини, що може корелювати з різницею в експресії cIAP2. Крім того, необхідно дослідити фізіологічну роль місцевої різниці в експресії cIAP2 в жировій тканині.
Підсумовуючи, ми порівняли експресію мРНК cIAP2 у жировій тканині SC та OM у 12 дітей та 11 дорослих. Вища відносна експресія ОМ порівняно з жировою тканиною СК була виявлена у дітей та дорослих. Це свідчить про те, що диференціальна експресія cIAP2 між депо може бути зумовлена власними властивостями клітин з двох депо. Більш виражена різниця в дитячих відкладеннях у дітей може відображати чисте збільшення вісцеральної жирової тканини під час росту.
Дякую
Цю роботу підтримали Фонд наукових досліджень Комітету з освіти Цзянсу (320012) та Шведська рада з медичних досліджень (19X-05708). Ми дякуємо д-ру Сю Сяокун, Лу Яо, Чень Іцзяну та проф. Пітер Нареді за надання зразка жирової тканини для цих досліджень та професор Томмі Олссон за плідні дискусії.