експресія

  • предметів
  • реферат
  • Головний
  • Матеріали і методи
  • Зразки тканин ендометрію та пацієнти
  • Вилучення РНК
  • Зворотна транскрипція в реальному часі та кількісна ПЛР
  • Імуногістохімічний аналіз втрати експресії PTEN
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Експресія мікроРНК у клінічних зразках
  • Панель мікроРНК, оптимізована як біомаркери для раку ендометрія
  • Статус PTEN у зразках тканин ендометрію та асоціація з експресією мікроРНК
  • обговорення

предметів

  • Рак ендометрія
  • Експресія гена
  • міРНК

реферат

Ми досліджували взаємозв'язок між часто нерегульованими мікроРНК (мікроРНК) та ендометричною патологією, намагаючись знайти найбільш надійні мікроРНК або комбінації мікроРНК для ідентифікації нормальних, гіперпластичних та злоякісних тканин ендометрія. Ми також вивчили взаємозв'язок між цими мікроРНК та статусом PTEN. Ми виміряли експресію шести мікроРНК (miR-21, 182, 183, 200a, 200c та 205) у 75 нормальних фіксованих, парафінових нормальних, гіперпластичних та злоякісних блоках тканини ендометрія за допомогою аналізів ПЛР у реальному часі. Втрати експресії PTEN оцінювали в тих самих тканинах ендометрія за допомогою імуногістохімії. Експресія п’яти miРНК (miR-182, 183, 200a, 200c та 205) була значно вищою при карциномі ендометрія (CA) порівняно зі складною атиповою гіперплазією (CAH), простою гіперплазією (SH) та нормальною тканиною ендометрія (P 1 Відповідно до У Національному реєстрі пухлин 2, 3 частота раку ендометрія в Кореї також значно зросла з 1991 по 2005 рік.

Клінікопатологічні та епідеміологічні дослідження підтвердили злоякісний потенціал гіперплазії ендометрія та концепцію континууму проліферативних уражень залоз, які в деяких випадках завершуються СА. 4 Точна діагностика та лікування цих передракових уражень настільки ж важлива для раку ендометрія, як і для раку шийки матки. Однак класифікація гіперплазії ендометрія є неоптимальною, наприклад, помилки кюретажу і суб'єктивна класифікація ВООЗ. 5 Діагностика такої передракової гіперплазії ендометрію, особливо критерії цитологічної атипії, що представляє суттєво підвищений ризик прогресування до СА, 6, 7, 8, є дуже суб’єктивною серед патологів і в більшості випадків демонструє низьку відтворюваність між посередниками 5, 7 результати запобігають класифікації гіперплазії ендометрію на основі ВООЗ для ефективного керівництва клінічним веденням та лікуванням пацієнтів. 5

МікроРНК - це невеликі некодуючі РНК, які беруть участь у розвитку пухлини. Вони регулюють експресію генів-мішеней шляхом деградації мРНК або трансляційної репресії. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 Кожна мікроРНК (miРНК) може загалом регулювати до сотень генів-мішеней. 9, 17 Під час розвитку пухлини аномальна експресія міРНК може або інактивувати гени-супресори пухлини, або активувати онкогени, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, сприяючи тим самим утворенню пухлини. 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18 Оскільки експресія міРНК є специфічною для тканини, 10 виявляється в крові 19 і корелює з клінічною поведінкою щодо раку, 20 міРНК є потенційно цінними біомаркерами.

Донедавна в декількох дослідженнях було виявлено або регульовані, або знижені регуляції мікроРНК у зразках тканин ендометрія. Вони застосували метод глобального профілювання 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або підхід міРНК-кандидата 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і показали, що аберрантна експресія міРНК пов'язана з гістологія пухлини, реагуючи 26, 27, 28 на стероїдну терапію 24 або хіміотерапію 29 та виживаючи. 21, 22, 25 Однак, більшість досліджень визначають експресію міРНК в нормальних тканинах ендометрія або раку, і можлива експресія міРНК при гіперплазії ендометрія в основному невідома.

Мутації PTEN були виявлені у понад 20% гіперплазій, з атипією або без неї, та у 30-80% CAs ендометрія, що дозволяє припустити, що зміни PTEN відбуваються на відносно ранній стадії ендогенного пухлинного розвитку. 4 Характеристика складного взаємозв'язку між міРНК та цільовим геном PTEN при ураженнях ендометрію може допомогти у подальшому визначенні деяких молекулярних шляхів, що обумовлюють канцерогенез. Тому ми вирішили шукати диференціальну експресію шести мікроРНК, про які найчастіше повідомляли при раках ендометрія 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 31, 36 та PTEN у різних тканинах ендометрію, щоб зрозуміти ендогенний канцерогенез та ці профілі експресії. використовуються в патолого-діагностичній галузі. Ці біомаркери допоможуть збільшити діагностичну відтворюваність гіперплазії ендометрія, а також покращать розрізнення між складною атиповою гіперплазією (САГ) та СА ендометрія. Очікується, що ці профілі експресії біомаркерів дозволять ідентифікувати пацієнтів з гіперплазією ендометрія, які супутньо переносять СА або мають ризик розвитку.

Матеріали і методи

Зразки тканин ендометрію та пацієнти

Всього отримано 75 архівованих фіксованих формаліном вкладених у парафін (FFPE) тканинних блоків нормального ендометрію (10 випадків), простої гіперплазії (SH, 21 випадок), CAH (22 випадки) та CA ендометрія (22 випадки). Патологічне відділення лікарні Св. Марії в м. Бучхон з 1994 по 2004 рр. Хворих було віком від 29 до 77 років із медіаною 47 років. З 22 CA, 16 були інвазивними до міометрії з 15 пацієнтами із замінником IA, 5 - замінником IB і 2 - замінником IIIC1 відповідно до стандартів Міжнародної федерації гінекології та акушерства.

Гістологічні діагнози досліджували два незалежні патологи. Нормальні тканини отримували у пацієнтів, яким зробили гістеректомію на предмет доброякісних патологічних ознак матки, таких як лейоміома, аденоміоз або опущення матки. Для цього дослідження використовувались лише тканинні блоки з гіперплазією або вмістом СА понад 80%. У випадку ендометріального СА ми відібрали лише добре диференційовані (ступінь 1) ендометріальні типи ендометріальних СА, оскільки вони є головними цілями, які ми повинні відрізняти від CAH.

Вилучення РНК

Загальну РНК з тканин FFPE витягували за допомогою набору для екстракції загальної нуклеїнової кислоти RecoverAll (Ambion, штат Техас, США) згідно з протоколом виробника. Концентрацію та чистоту РНК визначали за допомогою УФ-спектрофотометра.

Зворотна транскрипція в реальному часі та кількісна ПЛР

Зворотну транскрипцію в реальному часі та кількісну ПЛР проводили для таких мікроРНК: miR-205, miR-183, miR-200c, miR-200a, miR-182 та miR-21, використовуючи комплект зворотної транскрипції TaqMan MicroRNA та аналізи TaqMan. . у трьох примірниках (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Малий ядерний U2 2 (RNU6b) був використаний для нормалізації вхідної загальної малої РНК. Абсолютну кількісну оцінку для кожної miRNA, а також RNU6b проводили за допомогою стандартної кривої, генерованої послідовним розведенням зворотної транскрибованої загальної РНК, витягнутої з клітин VK2, і експресія кожної miRNA була представлена ​​як співвідношення між miRNA та RNU6b (RQ).

Імуногістохімічний аналіз втрати експресії PTEN

Статистичний аналіз

Тест Крускала-Уолліса був використаний для порівняння RQ експресії мікроРНК щодо патологічних висновків пацієнтів. Патологічна діагностика була використана як стандартне посилання. Була побудована характерна крива приймач-оператор та вибрані граничні значення для кожної miRNA та композитної панелі miRNA, що забезпечило високу загальну точність. Чутливість та специфічність при відмежуванні СА від інших тканин та CA від CAH розраховували для кожного обмеження. Також була оцінена площа під кривою, характерною для роботи приймача (AUC). Щоб визначити найкращу композитну панель miRNA, ми використали інформаційні критерії Akaike, які визначають найбільш підходящу модель на основі тесту ймовірності та кількості параметрів моделі. Різницю в експресії PTEN між патологічними групами перевіряли за допомогою тесту χ 2, а різницю в експресії мікроРНК між зразками PTEN та експресорними зразками - за допомогою тесту Манна-Уітні. Статистичну значимість для всіх аналізів визначали за двостороннім рівнем тесту 0,05.

результат

Експресія мікроРНК у клінічних зразках

Рівні експресії п’яти miРНК (miR-182, 183, 200a, 200c та 205) були значно вищими в CA ендометрія порівняно з CAH, SH та нормальною тканиною ендометрія (P

( a - f ) Рівні експресії miRNA-182, 183, 200a, 200c та 205 були значно вищими при карциномі ендометрія (CA) порівняно з нормальним ендометрієм (n1), одиночною гіперплазією (SH) або складною гіперплазією. Горизонтальна лінія позначає середнє значення. * P

( a - g ) Крива характеристик приймача та оператора (ROC) кривої рівня експресії miRNA. Площа під кривою ROC (AUC) для кожної мікроРНК вказує на її точність у диференціації раку ендометрія від гіперплазії ендометрія або нормального ендометрію. Усі значення P

( a - g ) Крива характеристик приймача та оператора (ROC) кривої рівня експресії miRNA. Площа під кривою ROC (AUC) для кожної міРНК вказує на її точність у диференціації карциноми ендометрія від складної атипової гіперплазії. Всі P

a - d ) Імуногістохімічна втрата ПТЕН у Росії a ) нормальний ендометрій (втрата PTEN, гетерогенна); b ) проста гіперплазія (втрата PTEN, гетерогенна); ( c ) складна атипова гіперплазія (втрата ПТЕН, негативна); a ( d ) карцинома ендометрія (втрата PTEN, негативна). Біла стрілка вказує на репрезентативну залозу з нульовим значенням PTEN, а чорна стрілка - на репрезентативну залозу, що експресує PTEN.

Повнорозмірне зображення

Дивно, але ми виявили суттєві відмінності між нормальною тканиною ендометрія або гіперпластичною тканиною та СА в п'яти з шести мікроРНК. Вища експресія miR-182, 183, 200a, 200c та 205 спостерігалась у СА ендометрія порівняно з CAH, SH та нормальною тканиною ендометрія. Всі шість мікроРНК показали статистично різну силу між СА та іншими типами тканин, причому miR-183 демонструє чутливість і специфічність понад 80%. Ми також виявили, що композитна панель із шести мікроРНК була статистично найкращим біомаркером.

З клінічної точки зору, в деяких випадках особливо важко розрізнити САГ та СА ендометрія, і правильний патологічний діагноз має вирішальне значення при лікуванні цих пацієнтів. У нашому дослідженні п'ять з шести мікроРНК показали вищу експресію в СА ендометрія порівняно з CAH. На основі аналізу AUC, окремі мікроРНК були показані по суті інформативними. Однак композитна панель із чотирьох miРНК, що складається з miR-182, 183, 200a та 200c, була найкращим комбінованим біомаркером для відмінності CA ендометрія від CAH.

Завдяки своїй високій чутливості та специфічності понад 90%, його можна використовувати як додатковий діагностичний інструмент у складних випадках.

PTEN є підтвердженою мішенню miR-219, 41 та передбачуваною мішенню miR-200c та 183. Прогнозовані мішені досліджували за допомогою //microrna.sanger.ac.uk/sequences. 21 Кілька досліджень повідомляють, що імуногістохімічні моделі експресії PTEN корисні як діагностичні маркери для розрізнення нормального, гіперпластичного та новоутвореного ендометрію. 8, 42, 43 Pavlakis et al. 44 припустили, що втрата PTEN та ядерна атипія EIN у біопсіях ендометрія можуть передбачити існування одночасної CA. Однак деякі інші дослідження не показали, що відсутність експресії PTEN має специфічність і відтворюваність, щоб бути клінічно корисним як біомаркер. 7, 45, 46 Тому ми вирішили визначити роль гена-супресора пухлини PTEN у пухлинах ендометрію та взаємозв’язок із змінами miRNA, включаючи специфічні miRNA, які, як вважали, націлені на гени супресорів пухлини PTEN. 9, 21

У цьому дослідженні відсоток втрати PTEN, включаючи PTEN-негативні та гетерогенні випадки, був значно вищим у CA та CAH ендометрії порівняно з SH та нормальним ендометрієм. Цікаво, що miR-200c значно регулюється в різних PTEN-негативних тканинах ендометрія. Однак, виходячи з наших даних, які показали невідповідність між втратою PTEN та експресією miR-200c в CAH, інший механізм або miRNA можуть брати участь у процесі втрати PTEN в ендогенному канцерогенному шляху. Незважаючи на те, що PTEN є підтвердженою мішенню для miRNA-21, і вважається, що miRNA-21 бере участь у патогенезі ендометріозу 24, 47 та мережі рецепторів естрогену, у нашому дослідженні miRNA-21, здається, не бере участь в ендогенному туморогенезі.,

Немає звітів про використання профілів експресії мікроРНК та PTEN для гістопатологічної диференціальної діагностики між простими CAH та CA ендометрія. Ми сподіваємось, що профілі експресії цих біомаркерів можуть допомогти нам з більшою визначеністю вибрати одну з кількох категорій уражень ендометрія, особливо при розмежуванні CAH та добре диференційованої CA ендометрія.