предметів
реферат
Блокада хемокінів CC є привабливою, але поки що невикористаною терапевтичною стратегією. Ми повідомляємо про фармакокінетику in vivo фармакокінетики вірусу вакцинії широкого спектру (35 К), білка хемокіну вірусу вакцинії, злитого з людським IgG1 Fc. Ми показали, що активність білка in vivo можна допитувати, використовуючи гідродинамічну доставку гена стандартної експресійної плазміди ссавців. Високі рівні білка 35 K-Fc у плазмі підтримуються принаймні 14 днів після передачі гена, причому білок все ще можна виявити через 5 тижнів. Ми підтверджуємо, що білок має біологічну активність при гострому запаленні, що спричиняє значне зменшення рекрутування моноцитів під час перитоніту, викликаного зимозаном. Здатність 35-K-Fc блокувати складніші патології демонструється за допомогою аортальних дайджестів для визначення опосередкованого ангіотензином II рекрутування лейкоцитів в аорту. Ангіотензин II спричинює надрегуляцію mCCL2 в аорті, що призводить до накопичення клітин CCR2 +. Пік відбору моноцитів в аорту настає протягом 3 днів, і цей процес залежить від хемокінів CC, тоді як він значно зменшується гідродинамічним введенням 35 K-Fc.
Хронічні запальні захворювання, такі як атеросклероз та ревматоїдний артрит, є основною причиною смертності та захворюваності. Цитокіни та хемокіни є важливими медіаторами запалення в цих умовах, і хоча існує модуляція біології цитокінів за допомогою біологічних препаратів, таких як Етанерцепт, Fc-злитий білок, що містить рецептор TNF і, таким чином, діючи як рецептор приманки, ліцензовані препарати, орієнтовані на хемокіни, є дуже обмежений 1. Незважаючи на те, що антагонізм CCR5 блокувати потрапляння ВІЛ з боку Maraviroc був успішним, на сьогоднішній день не існує ліцензованих препаратів, націлених на хемокіни, для хронічних запальних захворювань 2 .
Хемокіни - це малі розчинні медіатори білка, які регулюють передачу лейкоцитів. Виробництво цих молекул у місцях запалення або інфекції контролює набір лейкоцитів. Коли цей процес стає надмірним або розпочатий неправильно, може виникнути хронічне запалення та патологічне пошкодження тканин 2. Багато патогенних мікроорганізмів експресують білки, що полегшують імунну втечу господаря, нейтралізуючи аспекти реакції господаря, такі як вироблення хемокінів 3. Вірус вакцинії кодує розчинний білок 35 кДа, 35 К, який зв'язується з усіма CC-хемокінами людини та мишей, як правило, при спорідненості до зв'язування, більшій за спорідненість до зв'язування нативних рецепторів 4, 5, 6. Раніше ми вже показали, що аденовірус або лентивірус-опосередкований перенос гена 35 K ефективно знижує атеросклероз та хворобу венозних трансплантатів 7, 8. Інші групи повідомляли про придушення алергічного запалення на шкірі морської свинки та моделях запалення дихальних шляхів 5, 9. Незважаючи на те, що доставка вірусів продемонструвала корисність блокування анти-СС хемокінів у моделях доклінічних захворювань, вона не може вирішити питання щодо дози і навряд чи буде схвалена для терапії людьми, якщо необхідна передача генів.
Білки Fc-злиття зараз добре зарекомендували себе як терапевтичні засоби, дев'ять із них на сьогодні затверджені FDA 10. Додавання домену Fc, людського IgG1, у разі ліцензованих Fc-злиття, має низку переваг у створенні нових біологічних агентів. Домен Fc здатний зв'язуватися з новонародженими рецепторами Fc (FcRn), які експресуються на ендотеліальних, епітеліальних та певних клітинах лейкоцитів. Зв'язування молекули з FcRn захищає молекулу від розпаду лізосом, натомість молекули захоплюються через лунки, покриті клатрином, при цьому все ще зв'язуючись з FcRn, який спрямовує їх до ендосомних відділів, що дозволяють їм повернутися на поверхню клітини і повернутися в циркуляцію. 11. Ця властивість драматично впливає на період напіввиведення в сироватці крові, оскільки людський IgG має період напіввиведення 23 дні. Абатацепт, злитий білок CTLA-4 Fc, має період напіввиведення більше 10 днів 10 .
Білки Fc-злиття також сприяють очищенню нових біологічних препаратів, дозволяючи використовувати стандартні технології очищення антитіл та їх виявлення для фармакокінетичних досліджень за допомогою високоспецифічних реагентів для виявлення Fc 12. Хоча це може полегшити побудову та виробництво нових молекул в лабораторних масштабах, а не в промислових умовах, здатність продукувати велику кількість білків з мінімальним забрудненням ендотоксинами все одно може бути дорогою та трудомісткою. Ми поєднали невеликі експерименти з виробництва білка, щоб продемонструвати однодозову фармакокінетику та системну біодоступність нашого злитого білка 35 K-Fc з гідродинамічною доставкою тієї самої експресійної плазміди ссавців, яка використовується для отримання білка, щоб забезпечити ефективність білків. без спочатку потрібно розробити багаторазові стратегії дозування або виробити великі кількості високоочищеного злитого білка. За допомогою гідродинамічного введення ми продемонстрували корисність нашого білка, що зв’язує CC-хемокіни, мутант R89A 35 K-Fc, який ми вперше продемонстрували, ефективний у гострій моделі судинного запалення.
Матеріали і методи
матеріалів
Якщо не вказано інше, всі середовища для культивування клітин та буфери були отримані від Invitrogen (Великобританія). Всі лабораторні хімічні речовини були від Sigma-Aldrich (Гіллінгем, Великобританія), якщо не зазначено інше.
Всі дослідження на тваринах проводились з етичного схвалення Місцевого комітету з перегляду етики та відповідно до Закону Великобританії з питань внутрішніх справ (наукові процедури) 1986 року. Мишей утримували в клітинах з індивідуальною вентиляцією з 12-годинним циклом світло/темрява та контрольованою температурою 20 ° С). С - 22 ° С). Стандартні корми (Харлан, Великобританія) та вода були доступні за бажанням. Мишей C57bl/J купували у Harlan UK або для експериментів використовували гомозиготних мишей B6.129P2-Apoe tm1Unc/J, яких утримували в приміщенні.
35 Виробництво білка K-Fc та фармакокінетика
Білок 35 K-Fc отримували трансфекцією експресійних плазмід у клітини 293T та очищали спорідненістю до білка A, як опубліковано вище 13. Фармакокінетичні дослідження проводили шляхом внутрішньовенного введення 5 мкг білка 35 K-Fc з подальшим промиванням очеревини та забором плазми під час збору. Промивання очеревини проводили промиванням очеревини 5 мл PBS/5 мМ EDTA після забою.
Виробництво 35 K-Fc плазмід для ін’єкцій
35 K-Fc та мутантні версії були отримані у векторі pSecTag2 (C) (Invitrogen, Paisley UK), як опубліковано раніше 13. ДНК для ін’єкцій готували з використанням набору ДНК із низьким вмістом ендотоксину Maxi-prep (Qiagen, Великобританія) з використанням одноразового пластикового матеріалу, що не містить пірогену. Плазмідну ДНК розчиняли у воді без ендотоксинів у культурі тканин, аліквотували та зберігали при -20 ° C. Рівень забруднення ендотоксинів оцінювали за допомогою аналізу безмежних амебоцитів (QCL-1000) (Лонса, Великобританія).
Гідродинамічна доставка
5 мкг 35 K-Fc вводили внутрішньовенно внутрішньо мишам C57bl/6J. Порожнину очеревини промивали PBS, а плазму готували від мишей, зібраних протягом 7 днів після ін’єкції (n = 3 на момент часу). Концентрація 35 K-Fc в перитонеальному промиванні, розрахована як кількість, що залишилася на тварину ( A ) та плазмові концентрації ( B ) визначали методом ІФА. Біоактивність 35 K-Fc визначали за допомогою хемотаксичного біологічного аналізу. Плазму (10%) використовували як хемоаттрактант в аналізі хемотаксису в камері Бойдена. Кількість клітин, які мігрують до зразків плазми, розраховували як нормалізацію індексу міграції до величини випадкової міграції, що спостерігається лише буфером ( C. ). Концентрацію RANTES у плазмі крові 5 вимірювали методом ІФА ( D ). Концентрація 35 K-Fc у плазмі корелює з біоактивністю в плазмі ( Е ). n = 3 на момент часу, статистичний аналіз, проведений одностороннім тестом ANOVA та множинним тестом порівняння Даннета. * стор
Мишам вводили 1 або 10 мкг 35 K-Fc плазміди. Плазму збирали через 72 години після ін’єкції та імунопреципітували білками A/G. Гранули, що випали в осад, ідентифікували за допомогою Вестерн-блот, використовуючи анти-Fc та анти-35 K антитіла з очищеним 35 K-Fc як позитивний контроль та тваринам, яким вводили фізіологічний розчин як негативний контроль ( A ). Миші отримували гідродинамічну доставку 1 мкг 35 K-Fc плазміди, окремі когорти мишей збирали між 2 та 14 днями після ін'єкції та ізолювали зразки плазми та печінки (n = 3-5 на момент часу). Рівні плазми 35 K-Fc були визначені за допомогою ІФА ( B ) і повідомлення 35 K-Fc оцінювали за допомогою специфічних зондів 35 K taq-man в експерименті RT-PCR в режимі реального часу ( C. ) (* стор
обговорення
Ми продемонстрували in vivo корисність наших 35 реагентів K-Fc для перевірки ролі хемокінів CC у патології. Ми показали, що системне інгібування широкого спектру СС-хемокінів ефективно зменшує рекрутування мієлоїдних клітин у відповідь на перитоніт зимозану. Ми також продемонстрували, що 35K-Fc може блокувати надходження моноцитів на ранній фазі запалення судин, керованого AngII, і що спостерігається переважна блокада моноцитів замість отримання нейтрофілів. Крім того, ми продемонстрували корисність нашої платформи для тестування нових Fc-злитих білків без необхідності виробляти великі кількості очищеного білка. Наша попередня робота показала, що 35 мутантів K-Fc змінили здатність блокувати хемокіни CC in vitro та місцево in vivo при доставці до місця запалення. Зараз ми продемонстрували, що 35 білків K-Fc мають хорошу фармакокінетику в одній дозі, а також що вони мають системну активність при встановлених патологіях, залежних від CC-хемокінів.
Здатність отримувати докази біологічної активності, не виробляючи великої кількості білка, дозволяє швидше прогресувати і, в принципі, більший спектр білків перевіряти на активність. Подібний інгібуючий хемокіни вірус вакцинії 35 K Fc злитий білок (vCCI), випробуваний на моделі колатитового артрититу, вимагав введення кількох доз по 200 мкг для демонстрації біологічного ефекту 29. Під час експерименту це вимагало доставки 2 мг білка на мишу. Цей режим дозування асоціювався із втратою ефективності та генеруванням сильної антитілової реакції на vCCI-Fc протягом 14 днів після початку лікування 29. Ми експресували 35 K лентивірусів і спостерігали функціональне пригнічення захворювання протягом принаймні 3 місяців, набагато довше, ніж було досягнуто за допомогою vCCI-Fc7. Якщо вироблення Fc-злитого білка спричиняє посилену імунну відповідь, потенційно через вироблення нео-антигенів, це знову можна перевірити на використання модифікованих плазмід без необхідності багатодозових експериментів із використанням модифікованих білків.
Потужні імуномодулюючі терапевтичні засоби, такі як інгібітори TNFα, демонструють сильне пригнічення імунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит, але їх ефективність з часом може бути втрачена, що вимагає терапії другої лінії 30. Ефективність цитокінів, таких як TNFα та сімейство хемокінів CC, у таких важливих імунних функціях, як контроль інфекції, викликає справжнє занепокоєння щодо вигідності корисного впливу на захворювання проти компрометації здатності організму контролювати інфекції та рак. Однак успіх терапії TNFα-Fc свідчить про те, що добре відстежувані пацієнти можуть отримати значну користь від антицитокінових методів лікування. Асоціація хемокінів CC з такою кількістю хронічних захворювань, як атеросклероз, артрит та шлунково-кишкові захворювання, вказує на те, що інгібітори CC-хемокінів, такі як наші 35 мутантів K-Fc, можуть бути корисними як експериментальний інструмент для дослідження ролі цього класу молекули та як потенційні терапевтичні агенти 2 .
Детальніше
Як цитувати цю статтю: McNeill, E. et al. Гідродинамічна доставка генів зв’язаних білків Fc, що зв’язують CC хемокіни, для цільового гострого запалення судин In Vivo. Наук. Респ. 5, 17404; doi: 10.1038/srep17404 (2015).