- реферат
- Головний
- результат
- Нестача кисню викликає переробку LC3
- Гіпоксія індукує утворення аутофагосом
- Індукована гіпоксією аутофагія пухлинних клітин не залежить від HIF-1 та його цільових генних продуктів BNIP3 та BNIP3L
- Активність AMPK сприяє індукованій гіпоксією аутофагії
- ATG5 необхідний для аутофагії, спричиненої гіпоксією
- MEF з дефіцитом аутофагу є більш пухлинними у природніх умовах
- обговорення
- Матеріали і методи
- Клітинні лінії та хімікати
- плазміди
- Вестерн-блот
- імунофлюоресценція
- АО фарбування
- Вимірювання споживання кисню
- Поглинання 2DG
- Трансмісійна електронна мікроскопія
- Додаткова інформація
- Документи Word
- Додаткові зображення
- Додаткові легенди зображення
- глосарій
реферат
Головний
Низький кисневий стрес є загальною рисою ряду патофізіологічних станів, включаючи рак. Гіпоксія при солідних пухлинах пов’язана із стійкістю до променевої терапії та поганим прогнозом. 1 Одним із наслідків пухлинної гіпоксії може бути загибель клітин. 2, 3 Однак кілька груп показали, що пухлинні клітини, як правило, добре пристосовані до легкої гіпоксії за умови, що не виникає додаткових стресів, таких як депривація глюкози. Однак екстремальна гіпоксія здатна активувати апоптоз через процес, індукований гіпоксією фактор-1 (HIF-1). 4, 5, 6 Цікаво, що примусова нормоксична експресія цільового гена BNIF3 HIF-1 (аденовірус Bcl-2 E1a, білок 3, що взаємодіє з дев’ятнадцятьма кілодартонами) спричинила дисфункцію мітохондрій та загибель клітин в деяких, але не у всіх експериментальних умовах. 5, 7, 8 Недавні дослідження також були залучені до BNIP3 у кераміді та індукованій миш’яком аутофагії 9, 10 та в моделі ішемії/реперфузії клітинної смерті. 11
5'-AMP-активована протеїнкіназа (AMPK) є головним регулятором енергетичного гомеостазу. 12 Збільшення співвідношення AMP/ATP призводить до активації AMPK, який, у свою чергу, підтримує енергетичні катаболічні процеси та полегшує енергоємні анаболічні процеси. 13 Одним з основних шляхів цього ефекту є комплекс бульбового склерозу (TSC) та мішень для ссавців рапаміцину (mTOR). Гіпоксія є сильним стимулом AMPK, який не залежить від активності HIF і може виникнути до того, як буде помітно зниження рівня внутрішньоклітинного АТФ. 15, 16 Останні звіти свідчать, що на додаток до ролі AMPK у регуляції нормального гліколітичного та окисного метаболізму, він також може регулювати клітинний енергетичний гомеостаз шляхом автофагічної рециркуляції внутрішньоклітинних компонентів. 17, 18
Макроавтофагія (далі - аутофагія) - це катаболічний процес, що включає регульоване травлення клітинних макромолекул і навіть цілих органел. 19 Під час аутофагу частина цитоплазми секвеструється у двомембранних везикулах, званих аутофагосомами, які потім зливаються з вакуолями або лізосомами, де відбувається гідроліз вмісту або вантажу. 20 Вперше аутофагія була визначена в дріжджах як механізм виживання при зниженні поживних речовин. Пізніше було виявлено, що аутофагія є важливою для різних фізіологічних процесів у метазоях, таких як розвиток родючих тіл у Dictyostelium discoideum, ключових процесів у метаболізмі рослин, утворення пухирців у Caenorhabditis elegans, а також для розвитку ембріонів та виживання новонароджених у ссавців.
Випадки аутофагів у солідних пухлинах задокументовані; Однак незрозуміло, як цей процес сприяє біології пухлини. Беклін-1, гомолог ссавців гена аутофагії дріжджів ATG6, є гаплоїновим супресором пухлини. Встановлено, що гетерозиготна делеція гена BECN1 зменшує аутофагію, збільшує частоту виникнення спонтанних злоякісних новоутворень та прискорює розвиток індукованої HBV неоплазії. 23 Ектопічна реекспресія бекліну-1 у клітинах раку молочної залози людини посилювала аутофагію та знижувала пухлинність. Було також показано, що аутофагія захищає клітини ссавців від метаболічного стресу: наприклад, в IL-3-залежних гемопоетичних клітинах та в безсмертних клітинах епітелію нирок та молочної залози. 26, 27, 28 Однак є також докази того, що аутофагія може пригнічувати пухлинність шляхом ініціювання типу запрограмованої загибелі клітин. 29, 30
Сигнальні каскади, які сходяться та активують аутофагічні механізми в пухлинних клітинах, недостатньо вивчені. У цьому дослідженні ми показали, що гіпоксія здатна активувати аутофагію навіть за наявності поживних речовин та факторів росту в клітинах, здатних до апоптозу. Крім того, ця аутофагічна відповідь не залежить від сигналів HIF, вимагає експресії ATG5 і сприяє активності AMPK. Ембріональні фібробласти мишей з дефіцитом автофагу (MEF) демонстрували знижену мітохондріальну активність, збільшене засвоєння глюкози та дещо швидший ріст in vivo. Ми припускаємо, що ці метаболічні властивості клітин з дефіцитом аутофагів сприяють підвищенню їх пухлинності.
результат
Нестача кисню викликає переробку LC3
Виробництво AVO в умовах аноксиї. a ) Репрезентативні графіки зразків SiHa, пофарбованих АО. Клітини інкубували в 21 або ** P
Щоб поширити цей аналіз на BNIP3 та BNIP3L, ми використовували клітини RKO для повного аналізу функціональних втрат. У цій автофагічно компетентній клітинній лінії без експресії BNIP3 нокдаун BNIP3L створить клітинну лінію, дефіцитну в обох цих тісно пов'язаних білках. З цією метою клітини RKO стабільно трансфікувались shRNA, спрямованою проти нісенітниці (контроль) або BNIP3L. Колонії лікарсько-стійких клонів об’єднували і не обробляли або не піддавались гіпоксії протягом 24 годин. Додавали інгібітори катепсину, щоб допомогти виявити незначні відмінності в обороті LC3. Екстракти збирали для вестерн-блот (малюнок 3c). Ми виявили, що клітини RKO з shBNIP3L мали на 90% знижену експресію BNIP3L на додаток до експресії BNIP3. Потім ці набори були протестовані і показали хорошу продукцію AVO. Ні вираз BNIP3, ні BNIP3L не потрібні (або достатні) для активації автофагів у відповідь на гіпоксію (Рисунок 3c, середня панель).
Ми припустили, що відновлення експресії BNIP3 у цій конкретній клітинній лінії може змінити її метаболічну реакцію на гіпоксію через зміну мітохондріального числа/функції. Аналіз клітин, що надмірно експресують клітини BNIP3 або BNIP3L для зниження споживання кисню в мітохондріях, показав, що при опосередкованій PDK1 гіпоксії не було різниці у раніше повідомленому зниженні активності мітохондрій (рис. 3c, права панель). 37
Останні звіти свідчать про те, що ендоплазматичний стрес в сітківці (ER-стрес; погіршена реакція білка (UPR)) може активувати аутофагію. 38 Сильний дефіцит кисню є основним стимулом для УНП; тому ми досліджували, чи може послаблення цього процесу впливати на аутофагію, спричинену гіпоксією. MeFalized MEF дикого типу, ir-1 та -/- та PERK -/- піддавались гіпоксії протягом 24 або 48 годин, чого достатньо для індукції ER/UPR. 39 Обробка LC3 була виявлена у всіх зразках незалежно від їхнього статусу Ireland-1 a та PERK (додатковий малюнок S3). Цей результат свідчить про те, що аутофагія, індукована важкою гіпоксією, не залежить від повної реакції на стрес на УНП.
Активність AMPK сприяє індукованій гіпоксією аутофагії
AMPK є головним регулятором енергетичного гомеостазу. 12 Він активується багатьма стресами, включаючи гіпоксію. Отже, ми досліджували потенційну роль AMPK в індукованій гіпоксією аутофагії, використовуючи увічнені MEF, отримані або з ембріонів дикого типу, або з AM1K α1 та α2. Субодиниці α, які забезпечують каталітичну активність AMPK, були відсутні в цих клітинних лініях, що вибиваються, як було визначено вестерн-блот (рис. 4а). Як і очікувалось, дозозалежна активація шляху AMPK та фосфорилювання ацетил-КоА карбоксилази в умовах гіпоксичного стресу відбувались лише у MEF дикого типу (рис. 4а). Інкубація клітин дикого типу в EBSS протягом 3 годин також спричинила м'яке фосфорилювання ACC1/2. Експозиція клітин дикого типу 0, 5 або
Щоб визначити, чи мали ці процеси, які регулюються ATG5, клітинний вплив, ми протестували клітини дикого типу та нокаутували клітини ATG5 на ефективність покриття при помірній або важкій гіпоксії. Одноклітинні суспензії висівали і вирощували протягом 10 днів у 2 або 0,5% кисню і підраховували вижилі колонії. Клітини дикого типу продемонстрували значне зниження ефективності покриття при гіпоксії порівняно з клітинами, що нокаутують (Малюнок 5c, ліва панель). Для перевірки реакції на важку гіпоксію одноклітинні суспензії поміщали на пластини і піддавали дії кисню.
Втрата ATG5 трохи збільшує ріст модельних пухлин. a ) Імметалізовані нокаути дикого типу (WT) MEF та ATG5 (KO) трансформували Ras та вводили підшкірно у фланги жіночих голих мишей. Розмір пухлини вимірювали кожні 3 дні за допомогою штангенциркулів. ( b ) Ras-трансформовані криві росту пухлини MEF, в яких експресія ATG5 пригнічується доксицикліном. До питної води додавали доксициклін. c ) Для обробки LC3 in vivo потрібен ATG5. Пухлини цих генотипів були виділені, а свіжоприготовані білкові лізати використовувались для імунодетекції ATG5 та LC3. Мембранно-зв’язана форма LC3 (розбиті стрілки) виявляється лише в пухлинних лізатах, що експресують ATG5.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Зростаючий перелік (пат) -фізіологічних умов та хімічних сполук відомий своєю здатністю активувати аутофагію. Генетичні підходи допомогли зрозуміти важливість аутофагічного апарату під час нормального розвитку та викликали інтерес до біологічних наслідків його дерегуляції при захворюваннях, включаючи рак. Гіпоксія, дефіцит поживних речовин та виснаження факторів росту представляють стрес в мікросередовищі пухлини, який може ефективно активувати аутофагію. Наші результати показують, що дефіцит кисню може викликати аутофагію в пухлинних клітинах людини за відсутності додаткового стресу, такого як дефіцит глюкози або відмова сироватки.
Наші результати виявляють позитивну роль сигнального шляху AMPK в індукції аутофагії в умовах гіпоксії. З'являється все більше доказів, що підтверджують збережену роль AMPK в аутофагії, спричинену іншими стимулами, такими як вступ до стаціонарної фази дріжджів та лікування р53-активуючими або Ca 2+ -мобілізуючими агентами. Відомо, що активація AMPK відбувається після впливу гіпоксії, незалежно від HIF. 15, 16 Крім того, висновок про те, що нульові MEF TSC2 також стійкі до індукованої гіпоксією аутофагії, свідчить про те, що AMPK працює над TSC2 та через mTOR для регулювання процесу. 41 Той факт, що AMPK α-нулізиготні MEF не були повністю стійкими до аутофагії, підвищує можливість додаткових шляхів, що сходяться в основному автофагічному механізмі.
Матеріали і методи
Клітинні лінії та хімікати
Нокаут HIF-1 α та відповідні динамізовані SV40, увічнені MEF, були подарунком Р. Джонсона (Каліфорнійський університет, Сан-Дієго). 44 МЕП з нокаутом AMPK були описані в іншому місці. 15 TSC2 +/+ p53 -/- і TSC2 -/- p53 -/- увічнені MEF були подарунком від DJ Kwiatkowski (Гарвард, Бостон). Клітини шийки матки SiHa та RKO товстої кишки були придбані у ATCC. Ясноклітинні клітини нирок 786-0 та 786-0/VHL клітини були подарунком від A Giaccia (Стенфордський університет). Клоти клітин HeLa, які надмірно експресують білки BH3, були описані в іншому місці. 5 Ire-1 та PERK нокаут-клітини були подарунком від A Koong (Стенфордський університет). Нокаут ATG5, індуковані MEFs ATG5 та антитіла LC3 були добрим подарунком N Mizushima (Токійський медичний та стоматологічний університет). Всі клітинні лінії вирощували в DMEM з 10% фетальної бичачої сироватки та 20 мМ HEPES. Туморогенні клони були отримані з увічнених ATG5 дикого типу та нокаутуючих MEF шляхом стабільної трансфекції онкогенною плазмідою, що кодує Ha-ras.
Для лікування гіпоксії клітини інкубували у зволоженому гіпоксичному робочому місці (Invivo 2, Ruskinn Inc., Цинциннаті, Огайо, США) або анаеробному робочому місці з паладієвим каталізатором (Sheldon Corp., Cornelius, OR, USA). Кінцеві концентрації кисню підтверджували за допомогою полярографічного електрода типу Кларка (Animas, Frazer, PA, USA). В експериментах, що передбачають пригнічення деградації лізосом, клітини, висеяні в 12-лункові культуральні планшети, інкубували в 21 або 5, 37
Вестерн-блот
Клітини лізували в буфері RIPA, обробляли ультразвуком і концентрації білка, розраховані за допомогою BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Білки (10–20 мкг) розділяли в гелях Tris-Tricine і переносили на мембрани Hybond-P (Amersham, Piscataway, NJ, США). Використаними антитілами були мишачий анти-HIF-1 α (BD Transduction Laboratories, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), анти-LC3 кролячий поліклональ (MBL International, Woburn, MA, USA), мишачий анти-беклін-1 (BD Transduction Laboratories ), мишачий анти-ATG5 (Abnova), курячий анти-ATG5 (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США), мишачий антитубулін (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія, США), кролячий анти-Glut1 (Neomarkers, Freemont, Каліфорнія, США), миші проти GAPDH (Research Diagnostics, Конкорд, Массачусетс, США) та кози проти LDH A (Санта Круз Біотехнологія). Кроличі анти-AMPK, анти-АСС та анти-фосфо-АСС антитіла були придбані у Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Кроличі поліклональні антитіла проти BNIP3 та BNIP3L були описані в іншому місці. 5 Вторинні кон'юговані з лужною фосфатазою антитіла були від Vector Laboratories Inc. (Берлінгейм, Каліфорнія, США). Сигнали імуноблотингу візуалізували на підкладці ECF (Amersham) та виявляли за допомогою штормової камери (Molecular Dynamics, Саннівейл, Каліфорнія, США).
імунофлюоресценція
Клітини, висіяні у восьмикамерних предметних стеклах (Nunc), трансфікували експресійною плазмідою GFP-LC3, використовуючи Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Клітини фіксували 4% параформальдегідом, а ядра фарбували 10 мкг/мл Hoechst 33342. Клітини візуалізували на мікроскопі Nikon Eclipse E800, обладнаному цифровою камерою Spot RT Slider CCD (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, США).
АО фарбування
Зміни у внутрішньоклітинних кислих компартментах визначали за Кліонським 20 з незначними модифікаціями. Коротко, після обробки, клітини фарбували 2,5 мкг/мл АТ протягом 15 хв, трипсинізували, ресуспендували в PBS і негайно аналізували на проточному цитометрі FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Зелена та червона флуоресценції вимірювались у лінійній шкалі за допомогою каналів FL1 та FL3 відповідно.
Вимірювання споживання кисню
Клітини, висіяні в 100-мм пластинах для культури тканин, інкубували при 0,5 або 6 клітинах/мл, і споживання кисню вимірювали за допомогою електродного блоку Oxytherm (Hansatech, Норфолк, Великобританія).
Поглинання 2DG
2- [1,2,3-H (N)] - Дезокси-D-глюкоза була придбана у PerkinElmer (Бостон, Массачусетс, США). Клітини в шестилункових планшетах інкубували при 37 ° С під 21% або додавали 3D-мічений 2DG протягом додаткових 30 хв. Потім клітини двічі промивали холодним PBS і лізували 0,2 М NaOH/0,1% SDS. Радіоактивність вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника. Ідентичні серії зразків лізували в буфері RIPA для вимірювання концентрації білка.
Трансмісійна електронна мікроскопія
Клітинні моношари фіксували у 2% глутаральдегідному буфері. Зрізи фарбували уранілацетатом і цитратом свинцю та досліджували за допомогою просвічувального електронного мікроскопа Jeoll230.