глікозаміноглікани

  • предметів
  • реферат
  • Передумови:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • Головний
  • обговорення
  • методи
  • Ізоляція ГАГ
  • Бактерії та умови вирощування
  • Клітинні лінії
  • Визначення життєздатності клітин
  • Тест на аглютинацію
  • Експерименти з адгезією клітин
  • Адгезія Кишкова паличка O119 a S. fyris до клітинних моношарів у присутності GAG
  • Статистичний аналіз та етичне затвердження
  • Звіт про фінансову підтримку
  • розкриття інформації

предметів

реферат

Передумови:

У немовлят, які годують груддю, рівень гострого гастроентериту нижчий через наявність декількох протиінфекційних факторів у жіночому молоці. Метою даної роботи є вивчення здатності глікозаміногліканів людського молока (GAG) інгібувати адгезію деяких загальних патогенних бактерій.

методи:

GAG були виділені з набору проб молока, відібраних у різних матерів протягом першого місяця лактації. Були проведені експерименти для вивчення здатності GAG інгібувати адгезію двох кишкових мікроорганізмів (ентеропатогенних Escherichia coli серотипу 0119 та Salmonella fyris) до клітинних ліній Caco-2 та Int-407.

результати:

Дослідження показало, що GAG мали антиадгезивний ефект на два патогенні штами, що вивчались з різним ступенем інгібування. Особливо у присутності жіночого молока GAG адгезія S. fyris до клітин Caco-2 та до клітин Int-407 обох тестованих штамів була значно знижена.

висновок:

Наші результати показують, що ГАГ в грудному молоці можуть бути одним із важливих факторів захисту від гострих діарейних інфекцій у немовлят, що перебувають на грудному вигодовуванні.

Головний

У дитинстві різні бактерії, віруси та паразити відповідають за шлунково-кишкові інфекції. Є переконливі докази, що підтверджують кореляцію між грудним вигодовуванням та меншою частотою діареї. Насправді в жіночому молоці є кілька протиінфекційних засобів (секреторні антитіла, лактоферин, олігосахариди тощо) (1, 2). Зокрема, олігосахариди виконують кілька важливих захисних, фізіологічних та біологічних ролей, включаючи стимулювання росту корисних мікробіотиків кишечника та інгібування адгезії та імунорегуляції патогенів (3, 4).

Глікозаміноглікани (ГАГ) - високосульфатні, складні, лінійні природні полісахариди, утворені повторюваними дисахаридними одиницями. Зазвичай їх поділяють на чотири класи: гіалуронан, сульфат кератану, сульфатовані галактозаміноглікани, представлені хондроїтином сульфатом та сульфатом дерматану, що містять d-галактозамін, та сульфатовані глюкозаміноглікани з сульфатом гепарану та гепарин з d-глюкозаміном. Кожна конкретна дисахаридна одиниця складається із залишку гексозаміну (галактозамін або глюкозамін), який замінюється гексуроновою кислотою (глюкуроновою або ідуроновою кислотою), за винятком галактози, що містить кератансульфат. Сульфатні групи етерифікуються в різних положеннях вуглеводних каркасних ланцюгів, що утворюють структури, що мають високі гетерогенні послідовності та щільність заряду (5).

На відміну від олігосахаридів, ГАГ здатні специфічно (і специфічно) взаємодіяти з іншими біологічними компонентами завдяки наявності великої кількості сульфатних та карбоксильних груп, здатних генерувати високоспецифічні послідовності, що виробляють сильні аніонні взаємодії (5, 6, 7). В результаті було показано, що GAG людського молока можуть відігравати роль розчинних рецепторів і, отже, мають здатність інгібувати зв'язування різних патогенів зі слизовою оболонкою кишечника, захищаючи тим самим дитину від інфекцій. Крім того, нещодавно було показано, що гіалуронан людського молока стимулює захисний антимікробний захист у новонароджених (8).

Після новаторських досліджень Ньюбурга та співавт. (9), нещодавно було оголошено повну кількісну та якісну оцінку ГАГ, як щодо передчасного, так і передчасного грудного молока (10, 11). Кількісно найвища концентрація ГАГ була виявлена ​​в молозиві (9, 3 і 3, 8 г/л у передчасному та термічному молоці) з подальшим поступовим зниженням до 4, 3 та 0,4 г/л наприкінці першого місяця лактації. Ці дані вказують на те, що новонароджені, які перебувають на грудному вигодовуванні, отримують однакову кількість GAG щодня. З якісної точки зору, хондроїтин сульфат та гепаран сульфат/гепарин 55 відповідно. 42% загальних ГАГ, тоді як на сульфат дерматану та гіалуронан припадає решта 3% (12).

Молочні GAG синтезуються в молочній залозі шляхом послідовної дії специфічних глікозилтрансфераз, зв’язаних з білковим «ядром» і секретуються як протеоглікани. На рівні тонкої кишки протеолітичні ферменти, що виділяються в соку підшлункової залози, розщеплюють «ядро» протеогліканів, звільняючи ланцюги GAG. Оскільки стінки кишечника та мікроворсинки не містять специфічних глікозидаз та сульфатаз, вільні ГАГ залишаються неруйнованими у верхніх відділах шлунково-кишкового тракту (13), де вони можуть діяти як розчинні рецептори та виконувати протиінфекційну роль, як це було показано для людського молока. олігосахариди (14).

Метою цього дослідження є перевірити, чи здатний очищений комплекс GAG людського молока пригнічувати адгезію двох патогенних діарейних бактерій у дитячому віці, таких як кишкова паличка та Salmonella fyris (

Інгібування адгезії бактерій до клітин кишечника глікозаміногліканами (GAG). Адгезія (відсоток вихідного посівного матеріалу) E. coli O119 та S. fyris ( a ) і Caco-2 і ( b ) на клітинах Int-407 у присутності (сірі смуги) та відсутність (чорні смуги) GAG. Значення виражаються як середнє значення ± SD. Символи на малюнку вказують на статистично значущі значення порівняно з контролем. * P = 0, 012. ** P = 0, 0043. † P = 0, 0412.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Стандартна світлова мікроскопія пофарбованих за Гімзою клітинних моношарів, інфікованих E. coli O119. Адгезія до моношарів Int-407 в ( a ) відсутність і ( b ) у присутності глікозаміногліканів (ГАГ): у присутності ГАГ спостерігалося значне зменшення адгезії E. coli O119. Адгезія до моношарів Caco-2 за відсутності ( c ) a ( d ) GAG: у присутності GAG не спостерігалося впливу GAG на адгезію E. coli O119 до моношарів Caco-2. Збільшення = × 1000. Стрижка = 0,01 мм.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

обговорення

Мікробна інфекція - це складний процес, який в значній мірі залежить від взаємовідносин господаря та мікроба. Адгезія, як правило, є першим кроком до колонізації та подальшої інфекції (16). Різні клітинні компоненти еукаріотичних клітин та тканин були визначені як мішені для адгезії мікроорганізмів, і багато з них характеризуються як протеоглікани. Недавні дослідження показують, що вуглеводівмісні молекули замість білків опосередковують зв'язування бактерій з поверхнею еукаріотичних клітин (17). Описано ряд особливостей зв'язування вуглеводів, а в деяких випадках зв'язування бактерій з клітинами тварин безпосередньо пов'язано з взаємодією з ГАГ (18, 19). Загальний процес зв'язування включає зустріч сольватованого полігідроксильованого глікану, розташованого на поверхні клітини, із сайтом поєднання сольватованого білка (адгезином), присутнім у збуднику. Сили, що беруть участь у цьому зв’язку, представлені водневим зв’язком, взаємодіями Ван-дер-Уолла та зарядом і притяганням диполя (20, 21), припускаючи, що якщо поверхня на глікані є додатковою до місця об’єднання білка, вода може витіснитися і зв’язатися відбудеться.

Присутні на поверхні рецептори утворені олігосахаридними залишками глікопротеїнів та гліколіпідів клітинних мембран. Показано, що адгезія до цих рецепторів може інгібуватися або зменшуватися присутністю вільних олігосахаридів зі структурою, аналогічною структурі клітинних рецепторів, так що збудник зв’язується з ними, а не з клітинною мембраною, із зниженою патогенною дією завдяки до (22).

На сьогоднішній день наявні дані про активність олігосахаридів людського молока проти E. coli та S. fyris показують здатність фракцій, що містять фукозилові олігосахариди, пригнічувати адгезію ентеропатогенних E. coli O119. Крім того, антиадгезивний ефект на S. fyris, хоча і досить слабкий, був отриманий з низькомолекулярними кислими та нейтральними олігосахаридами (14).

Як вже було продемонстровано для інших вуглеводів людського молока (оліго), екзогенні ГАГ показали здатність конкурентних інгібіторів адгезії бактерій, серед яких гепарин вивчався найбільше (3, 23). Щодо можливої ​​фізіологічної ролі ГАГ у шлунково-кишковому тракті немовлят на грудному вигодовуванні, важливо підкреслити, що неперетравлені ГАГ потрапляють у тонку кишку, оскільки на стінці кишечника відсутні специфічні ферменти, які могли б їх погіршити. Отже, ці молекули можуть поводитися як розчинні рецептори, які мають здатність взаємодіяти з патогенами і конкурувати за їх адгезію до стінок кишечника.

Це дослідження підтверджує, що GAG ефективно інгібують адгезію S. fyris до клітин Caco-2 та Int-407 та адгезію E. coli O119 лише до Int-407. З іншого боку, наявність GAG не суттєво пригнічує адгезію E. coli O119 до клітин Caco-2. Значення адгезії клітин S. fyris та E. coli O119 до клітин Int-407 узгоджуються із значеннями, наведеними вище, порівнюючи різні конфігурації культури клітин як модель епітелію кишечника (24). Відсоток адгезії цих бактерій зменшувався, коли суспензії клітин спільно інкубували з GAG, припускаючи, що GAG можуть брати участь у взаємодії бактеріально-епітеліальних клітин.

Щодо E. coli O119 та відсутності специфічного інгібування адгезії до Caco-2, це явище можна пояснити різними молекулярними структурами рецепторів, що належать до двох типів клітин. Запас GAG людського молока може бути більш подібним до рецепторів Int-407, ніж GAG, розташований на Caco-2. Крім того, попередні дослідження припустили, що зниження прихильності зумовлене нижчим рівнем прикріплених білків, а не фізичним гальмуванням (25, 26). Різні ступені інгібування адгезії до клітин Int-407 порівняно з клітинами Сако-2 також можуть відображати походження (ембріональної та дорослої) двох клітинних ліній. Насправді клітини карциноми товстої кишки людини Caco-2, які зазвичай використовуються для вивчення адгезії кишкових збудників до клітин людини та цитотоксичності ентеробактерій, фізіологічно ближчі до природних цілей патогенів, оскільки такі ентероцити, як полярність клітин та верхівкова межа 27). З іншого боку, Int-407, який також використовується в експериментах з адгезією (28), є ембріональними клітинами кишечника людини, які, відповідно, мають різну молекулярну структуру (и) рецепторів порівняно з Caco-2.

Випробувані ГАГ людського молока ефективні проти S. fyris та E. coli O119, хоча різної інтенсивності. Також було показано, що ГАГ ефективні в інгібуванні зв’язування ВІЛ з рецептором GP-120 (9). Хілл та ін. (8) нещодавно показали, що гіалуронан людського молока пригнічує адгезію S. typhimurium до клітин. Наведені вище результати вказують на те, що GAG людського молока здатні діяти окремо на різні специфічні рецептори. Цей ефект може бути пов'язаний з їх гетерогенним складом, структурою та властивостями кожного окремого полісахаридного компонента. Наші поточні результати щодо здатності GAG людського молока інгібувати адгезію ентеропатогенів до клітин кишечника, як уже повідомлялося для олігосахаридів молока людини, є ще однією демонстрацією того, що антиінфекційний ефект жіночого молока обумовлений наявністю біоактивних речовин ) молекули, здатні захистити новонароджених від патогенних бактерій на шлунково-кишковому рівні.

На основі цих результатів будуть проведені подальші дослідження з використанням різних концентрацій ГАГ, а також одного очищеного компонента, що присутній у складних ГАГ, що містять жіноче молоко, щоб краще зрозуміти їх можливу фізіологічну роль та участь у гальмуванні механізму адгезії бактерій.

методи

Ізоляція ГАГ

ГАГ для людського молока отримували з набору зразків, відібраних протягом першого місяця лактації, і зберігали при -20 ° C до використання. Очищені вільні ГАГ отримували та виділяли, як детально описано (10). Коротко кажучи, окремі порції людського молока знежирювали ацетоном, і після центрифугування та сушіння при 60 ° С гранулу розчиняли у відповідному буфері та обробляли протеолітичним ферментом. Після кип'ятіння та центрифугування протягом 10 хвилин вільний GAG осаджували трьома обсягами етанолу. Осад отримували центрифугуванням, сушили при 60 ° С і очищали на колонці, упакованій аніонообмінною смолою. Фракції колони з позитивною уроновою кислотою (29), що містять вільний GAG, об'єднують і додатково осаджують етанолом. Нарешті, після центрифугування та сушіння, вільні очищені комплексні GAG людського молока аналізували на чистоту та склад та використовували для експериментів з адгезією.

Склад очищених ГАГ оцінювали за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (30) та визначення дисахаридів після специфічної ферментативної обробки (10). Чистота складних ГАГ була вищою, ніж 85%, як було визначено тестом на уронову кислоту (29) із залишком, що складається з солі та дуже низьким вмістом (