надбазальному

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Вплив супрабазальної інактивації фактора AP1 на епідермальну морфологію
  • Надбазальна експресія TAM67 збільшує проліферацію кератиноцитів базального шару
  • Надбазальна експресія TAM67 блокує утворення пухлини
  • TAM67 проти TPA: подібний фенотип
  • Обговорення
  • Фактори AP1: ключова роль у нормальному епідермісі
  • Вплив супрабазальної інактивації активності фактора AP1
  • Матеріали і методи
  • Трансгенні миші TAM67
  • Дослідження канцерогенності
  • Антитіла та імунологічні методи.
  • Глосарій

Предмети

  • Рак
  • Розмноження клітин
  • Онкогенез

Резюме

Вступ

Ми припустили, що фактори AP1 виконують різні функції в базальному (проліферативному) порівняно з супрабазальним (диференціюючим) епідермісом (Eckert et al., 2004). Однак перевірка цієї гіпотези ускладнюється тим фактом, що практично всі представники сімейства AP1 експресуються на певному рівні в базальному та надбазальному відділах (Welter and Eckert, 1995; Angel et al., 2001; Mehic et al. Al. ., 2005). Намагаючись зрозуміти роль факторів AP1 у епідермальному канцерогенезі, Колберн та його колеги використовували промотор K14 для спрямування експресії TAM67 до базального шару кератиноцитів (Young et al., 1999). TAM67 є домінуючою негативною формою c-jun, яка активно взаємодіє з усіма факторами AP1 для інгібування трансактивації (Brown et al., 1994). У цих цікавих дослідженнях інактивація фактора базального шару AP1 не призвела до явних змін у проліферації кератиноцитів або зовнішньому вигляді епідермісу або шкіри; однак миші були менш сприйнятливі до прогресування раку (Young et al., 1999; Thompson et al., 2002; Cooper et al., 2003).

Важливою метою цього дослідження було оцінити роль факторів AP1 у надбазальному епідермісі. Для цього ми створили мишей, у яких TAM67 експресується в надбазальних епідермальних шарах. Ми використовуємо індуковану систему, яка дозволяє оборотно активувати експресію TAM67 у надбазальному епідермісі шляхом введення доксицикліну (Dox) у питну воду. Наші експерименти показують, що надбазальна експресія TAM67 утворює потовщений гіперпроліферативний паракератотичний епідерміс, але, незважаючи на таку велику гіперпроліферацію, епідерміс стійкий до DMBA/TPA-залежного утворення пухлини.

Результати

Вплив супрабазальної інактивації фактора AP1 на епідермальну морфологію

Повнорозмірне зображення

Надбазальна експресія TAM67 збільшує проліферацію кератиноцитів базального шару

Збільшення товщини епідерми може бути обумовлене більшим виживанням клітин у надбазальних шарах, більшою адгезивністю клітин у багатошарових шарах або більшою проліферацією базальних клітин. Спочатку ми перевірили, чи впливає супрабазальна інактивація фактора AP1 на проліферацію базальних кератиноцитів. Щоб перевірити це, ми відстежуємо включення BrdU та рівень Ki67. Мишей, що експресують TAM67, обробляли BrdU протягом 2 годин, а зрізи тканин готували для виявлення BrdU та Ki67. Як показано на малюнку 2а, кількість позитивних ядер BrdU та Ki67 у п'ять разів вище у позитивному епідермісі TAM67 (+ Dox), що свідчить про те, що посилена проліферація базального та надбазального шару сприяє фенотипу.

Повнорозмірне зображення

Для подальшої оцінки впливу надбазальної експресії TAM67 на проліферацію та диференціацію клітин ми контролювали експресію маркерів епідермальної диференціації. Кератин K1, інволюкрин, філагрін та лорикрин зазвичай експресуються в диференційованих супрабазальних кератиноцитах (Eckert et al., 1997). У TAM67-позитивному епідермісі K1, інволюкрин та філагрін демонструють нормальну надбазальну експресію, що свідчить про те, що кератиноцити продовжують піддаватися диференціації (рис. 2b). Однак лорікрин, який зазвичай присутній у вигляді дискретної смуги у верхньому епідермісі, дифузно виявляється в декількох надбазальних шарах TAM67-позитивного епідермісу (рис. 2b). Крім того, відсутність супрабазальної функції фактора AP1 пов'язане зі зниженням рівня інволюкрину та лорікрину (рис. 2в); припускаючи, що надбазальна функція фактора AP1 необхідна для підтримки експресії цих генів.

Кератини K5 і K14 зазвичай експресуються в базальних кератиноцитах; однак у позитивних мишей TAM67 експресія спостерігається як в базальному, так і в надбазальному шарах. Наявність цих білків у надбазальному епідермісі узгоджується з ідеєю про затримку диференціації клітин. Крім того, ми виявили експресію кератину К6 на високому рівні, кератину, якого немає в нормальному епідермісі, але виявляють у гіперпроліферативному епідермісі (Sun et al., 1983).

Надбазальна експресія TAM67 блокує утворення пухлини

TAM67-експресуюче пухлинне утворення в надбазальному епідермісі. ( до ) Зменшення утворення пухлини у мишей, що експресують супрабазальний TAM67. Мишей TAM67-rTA обробляли або не застосовували одноразово місцеве застосування 100 мкг DMBA, після чого через 1 тиждень проводили обробку Dox та TPA або без нього протягом 22 тижнів, як описано в Матеріали та методи. Мишей спостерігали щотижня щодо появи пухлини, кількості та розміру. Кожна оброблена група включала десять тварин. Значення є середніми ± сем. Через 10-21 тиждень у групі DMBA + TPA було значно більше пухлин порівняно з групою DMBA + TPA (+ Dox), P 2)/2. Показані лише групи, які отримували DMBA/TPA (± Dox). Кожна група лікування включає десять тварин, а значення середні ± sem Розмір пухлини на 13-18 тижні був значно більшим у групі DMBA/TPA порівняно з групою DMBA + TPA (+ Dox), P

Відповідь на гостре лікування TPA. ( до ) Надбазальний позитивний епідерміс TAM67 нагадує шкіру, оброблену TPA. Мишей TAM67-rTA утримували у питній воді з Dox або без нього протягом 12 днів з подальшим місцевим застосуванням TPA, як зазначено. Через 24 год обробки ТРА тканину збирали та розділяли для фарбування H&E або інкубації із зазначеним антитілом. Флуоресцентні зображення - це конфокальні оптичні ділянки розміром 1 мкм. ( b ) Гостре лікування TPA збільшує проліферацію TAM67-позитивного епідермісу. Мишей TAM67-rTA витримували на дієті Dox протягом 12 днів. Потім епідерміс оголювали 10 мкг TPA/100 мкл ацетону, а тканину збирали через 24 години для фарбування Ki67.

Повнорозмірне зображення

Потім ми досліджуємо, чи виявляється гіперпроліферація, яка спостерігається в епідермісі, також на рогівці. Як показано на малюнку 5а, TAM67-FLAG експресується на порівнянних рівнях як в епідермісі, так і в епітелії рогівки. Однак, на відміну від епідермісу, експресія TAM67 в епітелії рогівки не викликає гіперпроліферації (Рисунок 5b), що свідчить про те, що TAM67-залежна гіперпроліферація спостерігається лише у вибраних епітеліях.

Відсутність реакції в епітелії рогівки. ( до, b ) Висока експресія TAM67-FLAG в епітелії рогівки миші. Мишей TAM67-rTA обробляли з Dox або без нього протягом 12 днів, а епітелій епідермалу та рогівки збирали для аналізу рівня TAM67-FLAG та підготовки гістологічних зрізів. Результати імуноблоту нормалізуються на основі виявлення β-актину (не показано).

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Фактори AP1: ключова роль у нормальному епідермісі

Мережа факторів транскрипції AP1 включає членів jun (c-jun, junB, junD) і fos (c-fos, FosB, Fra-1, Fra-2). Вони утворюють гомодимери та гетеродимери jun-jun та jun-fos, які взаємодіють з консенсусними ділянками зв'язування ДНК на генах-мішенях для регулювання експресії генів. Фактори AP1 є ключовими інтеграторами передачі сигналу в епідерміс, які опосередковують надходження цитокінів, факторів росту, диференціюючих агентів та промоторів росту. Ці сигнали протікають через каскад активованих мітогеном протеїнкіназ, що призводить до порушення функції фактора AP1. Фактори AP1 контролюють проліферацію кератиноцитів (Takahashi et al., 2002; Shi and Isseroff, 2005; Mizuno et al., 2006), диференціацію (Eckert et al., 2003, 2004; Adhikary et al., 2004) та апоптоз (Efimova et al., 2004; Raj et al., 2006), і важливі для прогресування пухлини та розвитку псоріазу (Kahn et al., 1993; Saez et al., 1995; Rutberg et al. al., 2000; Eckert et співавт., 2002, 2003, 2004; Єфімова та ін., 2002, 2003, 2004; вона та ін., 2002; Іізука та ін., 2004).

Вплив супрабазальної інактивації активності фактора AP1

У цьому дослідженні ми досліджуємо вплив супрабазальної інактивації фактора AP1 на диференціацію та проліферацію кератиноцитів. Ми вибрали в якості моделі, вказуючи домінантно-негативний вираз c-jun (TAM67) на надбазальний епідерміс. Цей підхід має ряд переваг. По-перше, TAM67 перешкоджає функції всіх факторів транскрипції AP1 (Brown et al., 1994). По-друге, використання промотору інволюкрину дозволяє направляти TAM67 на надбазальний епідерміс і полегшує проблеми, що спостерігаються у нокаутованих мишей, де білок втрачається з усіх шарів. По-третє, вже існує модель, націлена на базальний шар TAM67 (Young et al., 1999, 2002; Thompson et al., 2002; Cooper et al., 2003; Matthews et al., 2007), яка дозволяє порівняти вплив базальної та надбазальної інактивації фактора AP1.

Відповідно до уповільненої диференціації, кератини K5 та K14, які зазвичай експресуються виключно в базальному шарі, виявляються у всіх епідермальних шарах. Це говорить про те, що події, необхідні для інактивації виразу K5 та K14, скомпрометовані. Крім того, K6 експресується у всіх шарах епідерми. K6 - це кератин, який експресується в умовах гіперпроліферації, але не експресується в нормальному епідермісі. K6 експресується в псоріазі, епідермісі, обробленому ефіром форболу, та інших станах, пов'язаних з гіперпроліферацією кератиноцитів (Sun et al., 1984; Heyden et al., 1994a, 1994b; Iizuka et al., 2004). Таким чином, надбазальна експресія TAM67 призводить до посиленої проліферації базального шару та уповільненої диференціації, і в кінцевому підсумку призводить до екстенсивного гіперкератозу.

Завдяки гіперпроліферативному фенотипу, ми припускаємо, що надбазальні миші TAM67 будуть сприйнятливі до утворення пухлини. У позитивних або негативних мишей TAM67, які отримували DMBA, пухлин не утворювалось; однак лікування DMBA/TPA призвело до утворення пухлини. Було несподіванкою виявити, що DMBA/TPA-залежне утворення пухлини помітно знижується у супрабазальних мишей TAM67. Це свідчить про те, що, хоча TAM67 призводить до посиленої епідермальної проліферації, це не перетворюється на посилене утворення пухлини. Ми розглядаємо можливість того, що TAM67 може перешкоджати активізації проліферації TPA у протоколі канцерогенезу. Однак наші експерименти свідчать про те, що епідерміс, що експресує TAM67, повністю компетентний реагувати на TPA. TAM67-позитивний епідерміс має в п'ять разів більше Ki67-позитивних базальних клітин, і більшість супрабазальних клітин також є позитивними.

Ці дослідження вказують на те, що TAM67 має чіткий вплив на епідермальну функцію. Однак цікаво, що експресія TAM67 не впливає на епітелій рогівки (рисунок 5). Цей висновок свідчить про те, що не всі тканини можуть реагувати на порушення функції AP1. Незрозуміло, чому епітелій рогівки був би стійким до впливу TAM67 на функцію фактора AP1, але цікаво, що епітелій рогівки дуже стійкий до раку (Cutler, 2004).

Матеріали і методи

Трансгенні миші TAM67

Дослідження канцерогенності

Антитіла та імунологічні методи.