сектор

Методи випробувань

Існує ряд різних методів визначення афлатоксинів, більшість з яких є у продажу.

Широкий вибір варіантів випробувань дозволяє нам вибрати найбільш підходящий метод вимірювання для даних умов.

Залежно від складності, доцільності та часу, необхідного для процедур, методи поділяються на дві основні категорії: швидкі методи, довідкові методи.

Швидкі методи

Швидкі методи необхідні для аналітичних результатів, доступних за короткий час.

Ці процедури дозволяють проводити прості у виконанні тести з меншими витратами, навіть на місці відбору проб.

Якщо вміст мікотоксину у партії потрібно підтвердити швидким тестом, як у випадку з еталонними методами, спочатку слід переконатись, що зразок репрезентативний.

Тестова сполука (речовини) повинна бути витягнута перед тим, як продовжувати випробування зразків.

Щоб визначити точні кількісні результати, оцінку слід проводити за допомогою приладу виявлення.

Хоча тести, які дають якісні (так/ні) або напівкількісні результати (розташування результату в заданих межах, наприклад, від 0,5 до 1 проміле), як правило, можуть оцінюватися візуально неозброєним оком.

Кілька різних технологій можуть бути використані у швидких методах, розроблених для аналізу афлатоксинів.

Найпоширенішими є імуноферментний аналіз (ІФА), імунохроматографічна тест-смужка (ЛФД) та хімічні методи.

Методика ІФА, що включає методи імунологічного аналізу, використовує антитіла, специфічні для досліджуваного компонента, для якісного або кількісного визначення мікотоксинів в аналітичній пробі.

Результати визначаються ферментно-пов'язаною кольоровою реакцією, де інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації досліджуваного мікотоксину.

Тести ELISA конкурентного формату, як правило, використовуються для виявлення мікотоксинів, отже, виміряна інтенсивність кольору обернено пропорційна концентрації тестового компонента.

Ці тест-системи ІФА дають кількісні результати за короткий час і є чудовими інструментами скринінгу, які часто використовуються на місці відбору проб.

Однак перехресні реакції з молекулами, дуже схожими на досліджувану речовину та ефекти матриці, що спостерігаються в різних продуктах, можуть вплинути на результати випробувань.

Кількісне визначення всіх афлатоксинів, афлатоксину B1, загальних афлатоксинів (B1, B2, G1 та G2), афлатоксину M1 може бути проведене методом ІФА.

Виробники тестів враховували різні порогові значення в різних регіонах.

Отже, виходячи з поточних вимог, яким слід дотримуватися, будь то місцеві граничні значення або порогові показники, що діють у країні призначення експорту, можна вибрати тести з відповідною чутливістю.

При використанні методів ІФА рекомендується перевірити список зразків матриць, затверджених виробником разом із цим набором.

За допомогою методики ІФА значну частину сільськогосподарської сировини можна випробувати відповідно до інструкцій виробника, без використання спеціальних етапів очищення.

Однак тестування ІФА більш складних типів зразків, таких як комбікорм, може призвести до неточних результатів.

Щоб уникнути цього, рекомендується проконсультуватися з виробником випробувань з урахуванням конкретного зразка, що підлягає випробуванню.

Імунохроматографічні тест-смужки з’являються як ще одна застосовна технологія на ринку швидких тестів на мікотоксини.

Метод заснований на виявленні тестового компонента шляхом зчеплення з певним антитілом у зоні тестування, яке розташоване на мембрані на тест-смужці.

На додаток до тестової зони, на мембрані була встановлена ​​контрольна зона для перевірки належної роботи тесту.

Коли екстракт зразка протікає через мембрану, проходить через зону випробування та контролю, залежно від концентрації токсину, буде видно або те, і інше (тестове та контрольне), або лише контрольна лінія.

Тест-смужку можна оцінити неозброєним оком, візуально або за допомогою приладу для читання.

Якщо потрібні кількісні результати, оцінка проводиться за допомогою приладу (відбивного фотометра), який вимірює інтенсивність тестової та контрольної ліній, а потім оцінює результати на їх основі.

Імунохроматографічна тест-смужка - це швидка, проста у виконанні техніка, ідеальна та економічно вигідна для тестування навіть однієї проби, і її можна проводити в місці відбору проб.

Як і в методі ІФА, перехресні реакції та ефекти матриці під час випробування окремих продуктів обмежують придатність тест-смужки.

Імунохроматографічні тест-смужки доступні як у якісній, так і в кількісній формі для визначення афлатоксинів.

Ці випробування були підтверджені на по суті простих зразкових матрицях, тобто їх використання рекомендується для скринінгу сировини.

Найпоширенішим прикладом хімічних тестів, що використовуються для визначення афлатоксинів, є флуориметричні тест-системи.

Після екстракції компоненти, що заважають випробуванню, повинні бути видалені із зразка на етапі очищення, а потім флуоресцентні властивості досліджуваної речовини повинні бути посилені дериватизацією.

Світло, яке випромінює очищений аналіт при збудженні, оцінюють за допомогою флуориметра.

Ця методика, як правило, використовується для вивчення афлатоксинів, оскільки ця група мікотоксинів має сильні природні флуоресцентні властивості.

За допомогою такого кількісного, недорогого тесту можна отримати результати за короткий час, навіть для зразка.

Однак застосування методу обмежується компонентами з флуоресцентними властивостями, а деякі продукти мають матричні ефекти, які можуть вплинути на результати аналізу.

Флориметричні тести пропонують швидку та надійну альтернативу для визначення всіх афлатоксинів (B1, B2, G1 та G2).

Довідкові методи

Якщо випробовується матриця, яка через свою складність відсутня у списку речовин, затверджених виробниками випробувань, або слід підтвердити результат швидкого випробування, зразок слід випробовувати, використовуючи еталонні методи.

Довідкові методи визначення афлатоксинів засновані на хроматографії, включаючи інтенсивну рідинну хроматографію (ВЕРХ).

Різниця між методами обумовлена ​​типом детектора, який використовується після поділу, а у випадку флуоресцентного детектування - методом дериватизації.

Для визначення афлатоксинів можна використовувати зв’язані системи ВЕРХ-FLD та LC-MS/MS.

Якщо відокремлені копмоненти визначають за допомогою флуоресцентного детектора, необхідна дериватизація після колони для збільшення природних флуоресцентних властивостей афлатоксинів B1 та G1.

Цю дериватизацію можна здійснити кількома способами: електрохімічним або фотохімічним.

Трифтороцтова кислота або K-бромід можуть бути використані як активний інгредієнт при електрохімічній дериватизації.

Однак агресивні хімічні речовини, що скорочують термін експлуатації приладів та капілярів, можуть бути спричинені фотохімічною дериватизацією.

Останній метод заснований на тому, що опромінення ультрафіолетовим світлом при 254 нм збільшує флуоресцентні властивості компонентів афлатоксину B1 та G1 способом, еквівалентним електрохімічній дериватизації (Papadopoulou - Bouraoui et al, 2002).

У випадку афлатоксину М1 у молоці та молочних продуктах дериватизація не потрібна, оскільки цей компонент може бути випробуваний з достатньою чутливістю за допомогою приладу HPLC-FLD.

Прилади ВЕРХ характеризуються високою чутливістю.

Тому для отримання гарних результатів рекомендується очистити екстракт зразка перед ін’єкцією на колонку ВЕРХ.

Очищення можна проводити за допомогою колони для твердофазної екстракції (SPE) або колони з імуноафінністю.

У випадку колонок SPE наповнювач колони пов'язує будь-які заважаючі речовини з розчину зразка і дозволяє пропускати крізь колону лише речовини, що мають відношення до випробування.

Ефективність очищення залежить від взаємодії екстракційного розчинника, матриці зразка та насадки колонки.

Колонки для імунного очищення містять антитіла, селективні для досліджуваних мікотоксинів, які знаходяться в гелі на колонці.

Після нанесення екстракту зразка на колонку антитіла зв'язують в ній афлатоксини.

Потім рекомендується промити колону, наприклад, дистильованою водою, щоб видалити незв'язаний матеріал відповідно до інструкцій виробника щодо використання.

Після промивання мікотоксини розчиняються з гелю, який в ідеалі містить лише зв’язані мікотоксини, з сильним органічним розчинником (наприклад, 100% метанолом).

Для підвищення чутливості методу доцільно випаровувати розчинник з елюату, а потім розчиняти випарений мікотоксин у рухливій фазі ВЕРХ перед його ін'єкцією.

Довідкові тести включають все більше використання систем LC-MS/MS в аналізі мікотоксинів, які представляють найдосконаліші аналітичні стандарти.

Існують мультитоксинні методи, які дозволяють визначити кількість законодавчо регульованих мікотоксинів (12 компонентів) у зразку за 15 хвилин.

Широкому використанню цих високоефективних інструментів заважає висока вартість товарів та вартість персоналу, придатного для професійної експлуатації та розробки методів.

Відбір проб

Який би метод вибору не був обраний для вимірювання афлатоксинів, не можна ігнорувати один із ключових елементів у визначенні мікотоксинів, відбір проб.

Вибірка - це статистична процедура, при якій визначена кількість вибірок відбирається з більшої партії таким чином, що співвідношення та розподіл досліджуваного параметра однакові як в сукупності (контрольна партія), так і в частині, яка вилучається (зразок).

Потім зразок піддають тестуванню, щоб на основі його результатів зробити обґрунтовані висновки для сукупності.

Дослідження мікотоксинів - це складний процес, який в основному складається з трьох частин:

  • ми беремо кілька менших зразків з партії, які слід досліджувати випадковим чином, а потім об'єднуємо їх у єдину велику "вибірку партії"
  • вся партія подрібнюється до дрібного розміру частинок, а невелика кількість, "аналітична проба", відбирається шляхом репрезентативного підвідбору
  • мікотоксини витягуються з аналітичного зразка і остаточно визначаються кількісно

Останнім часом спостерігається постійний розвиток аналітичних методів визначення мікотоксинів.

Однак, навіть якщо ми працюємо за прийнятою процедурою тестування, нам доводиться рахуватися з тим, що кожен з цих етапів може змінюватися.

Дослідження ряду вчених підтверджують, що відбір проб, як правило, є найбільш значним джерелом помилок у вивченні мікотоксинів.

Наприклад, майже 90% помилок в аналізах афлатоксину можна віднести до відбору проб.

Значні помилки вибірки при тестуванні мікотоксинів можна віднести до двох основних факторів: концентрація мікотоксинів у досліджуваних продуктах є дуже низькою ("проблема ppb") і їх розподіл не є рівномірним у досліджуваних партіях.

Хоча рівень мікотоксину в деяких зернах надзвичайно високий, загальна концентрація мікотоксину у більшій партії круп зазвичай є дуже низькою.

Одиницею виміру, яка зазвичай використовується, є "частин на мільярд" (ppb - 1 частина на мільярд).

Однак ми не можемо ігнорувати той факт, що афлатоксини впливають на здоров'я людини і тварин навіть при таких низьких концентраціях.!

На відміну від білка або вологи, мікотоксини містяться не в усіх зернах.

У крайньому випадку мікотоксини присутні лише на кількох зернах або зернах на цілому злаковому полі.

Це означає, що, хоча деякі зерна мають високий рівень токсинів, інші зерна взагалі не містять токсинів.

Це пов’язано з тим, що цвіль не росте рівномірно на полях чи сховищах для зерна.

Таким чином, мікотоксини також, як правило, концентруються в плямах, які називаються фокусними точками, тоді як решта партії вільна від токсинів.

Однак, чим більший ступінь забруднення, тим більша ймовірність його більш рівномірного розподілу.

В іншому випадку, коли концентрація токсину в партії злакових культур низька, нерівномірний розподіл стає більш вираженим.

У разі правильно проведеного випробування визначається середнє забруднення перевіреної партії.

Якщо не дотримуватися правильної процедури відбору проб, результат випробування, швидше за все, буде нижчим за конкретну партію справжньої концентрації мікотоксину (наприклад, якщо відбирають проби лише з вільних від токсинів або злегка забруднених ділянок) або, навпаки, вищий (коли „ координаційні центри ”беремо зразок).

Помилково негативні результати дуже часто зустрічаються при тестуванні на мікотоксини, в основному через неадекватну вибірку та підготовку зразків.

Коли відбирається невелика кількість додаткових зразків або загальна додаткова проба занадто мала, існує набагато більша ймовірність того, що забруднені зерна будуть «пропущені», ніж якщо ми вдаримо їх, і вони будуть включені в досліджуваний зразок.

Такі типи результатів також мають місце, коли перед здрібнюванням розподіляється вся партійна проба.

Помилково негативні результати зазвичай становлять близько 5%, але можуть досягати і 90%!

З іншого боку, хибнопозитивні результати вищі за репрезентативне значення.

Цей тип результату зустрічається рідше, ніж помилково негативний результат.

Однак як помилково негативні, так і хибнопозитивні результати є згубними, оскільки можуть бути джерелами значних економічних втрат

Важливість правильної вибірки стає очевидною, коли ми враховуємо, що, наприклад, залізничний вагон становить 55-80 т, а причіп для вантажівки - приблизно. У ньому міститься 20 т кукурудзи, з яких досліджується від 20 до 50 г наземної проби, яка повинна відображати всю партію.

Повинні бути використані відповідні методи відбору проб, щоб переконатись, що досліджуваний зразок є репрезентативним.

Зразок, відібраний із самого верхнього шару зерна, що перевозиться у залізничному вагоні чи вантажівці, або зразок "відро", відібраний під час розвантаження транспортних засобів, НЕ є репрезентативним для перевіреної партії, а тому не рекомендується.

Відбираючи лише частину потоку зерна, пробовідбірники також можуть впливати на те, якою мірою проба характеризує партію, що тестується.

Тому відбір зразків лопати або рук заборонено під час офіційних випробувань.

Розподіл таких компонентів, як фракції або сторонні речовини, як правило, нерівномірний протягом усього навантаження.

Коли зерно спорожняється в контейнер (вагон, фургон або силос), інгредієнти розділяються відповідно до їх розміру, щільності та форми.

Під час зберігання дрібніші частинки концентруються поблизу центру, а більші матеріали та частинки мігрують назовні контейнера.

Під час пошуку спостерігається зворотна сегментація.

Ці явища пояснюють, чому застосування правильної схеми відбору проб та достатньо велика кількість додаткових зразків є ключовими для забезпечення того, щоб проба насправді мала характеристики перевіреної партії.

Щодо мікотоксинів, ми часто стикаємося з питанням: "Який найкращий спосіб провести тестування на той чи інший токсин?"

Багато хто вважає, що ми можемо отримати точні результати лише за допомогою сучасних високоцінних інструментальних тестів.

Лише найвища чутливість, вибірковість і найнижча межа виявлення можуть бути достатньо хорошими.

Тільки якщо ми приділимо належну увагу відбору зразків і зробимо це з відповідальністю, ми можемо заявити, що дорогі технології тестування - це не марні витрати грошей?!