предметів
реферат
Тут ми представляємо кількісну оцінку впливу AgNP на біомасу, фотосинтетичну активність, морфологію клітин, проникність мембран, активність естерази та окислювальний стрес представницької ґрунтової водорості Chlamydomonas reinhardtii 23 у ґрунті. Цей підхід може забезпечити ефективний засіб оцінки потенційної токсичності наноматеріалів на основі реакції ґрунтових водоростей та кількісних показників токсичності AgNP у ґрунті.
методи
Випробування видів та докультури
Chlamydomonas reinhardtii був отриманий з Техаського університету, Остін, США. Клітини водоростей інкубували в триацетат-фосфатному середовищі за допомогою 250-мл боросилікатного скляних колб з повітропроникними пробками і культивували при 24 ± 2 ° C, струшуючи при 100 об/хв і 16: 8 год (світло: темно) - фотоперіод забезпечуються яскраво-білими люмінесцентними лампами (
реагенти
Порошок AgNP (17. Зразки (1 г) грунту переносили на 6-лункову мікропланшету з плоским дном (діаметр 35 мм, висота 22,5 мм для кожної лунки)) додавали деіонізовану воду для регулювання вмісту вологи в досліджуваному ґрунті до 90% його водозберігаючої здатності Як тільки дослідне середовище було насичене деіонізованою водою, на поверхню ґрунту засівали 0,13 мл C. reinhardtii під час експоненціального зростання (тобто початкова щільність 6,5x105 клітин/г у досліджуваному середовищі). з трьох зразків. 0,13 мл деіонізованої води (замість суспензії водоростей) додавали таким же чином, щоб скорегувати фонову флуоресценцію в аналізі біомаси або виключити вплив тонких твердих речовин ґрунту в проточній цитометрії. Мікропланшети інкубували протягом шести днів в тих самих умовах попередньої культури, за яких C Крім того, необроблені ґрунти та послідовні розчини іонного Ag додавали в лунки для оцінки токсичності іонного Ag таким же способом, як і обробка. AgNP або насипний ґрунт, оброблений Ag та AgNP. Подібним чином, деіонізована вода використовувалась замість іонного Ag у контролях.
Добування ґрунтових водоростей з AgNP, сипучих Ag або іонних ґрунтів
Для вилучення інтактного C. reinhardtii, вирощеного в кожному середовищі, до кожної проби ґрунту додавали 5 мл базального середовища Болда (BBM), а потім мікропланшет струшували протягом 24 годин в умовах попередньої культури. Отриману супернатант використовували для аналізу біомаси, фотосинтезу та проточної цитометрії через 5-хвилинний осад.
Аналіз біомаси
Для вилучення хлорофілу а з C. reinhardtii суспензію водоростей змішували з етанолом (співвідношення водоростей: етанол 1: 4) і струшували в темряві протягом 3 годин в умовах попередньої культури. Флуоресценцію хлорофілу вимірювали для кількісного визначення біомаси водоростей за допомогою флуоресцентного зчитувача мікропланшетів (Gemini; Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія, США) при довжині хвилі збудження 420 нм та довжині хвилі випромінювання 671 нм24.
Фотосинтетичні аналізи
Для аналізу фотосинтетичної здатності C. reinhardtii суспензію водоростей дозволили пристосувати до темряви протягом 15 хвилин. Потім для аналізу параметрів системи Photosystem II використовували Handy Plant Efficiency Analyzer (PEA; Hansatech Instruments Ltd., Kings Lynn, Norfolk, UK): загальна додаткова площа (площа), максимальний квантовий вихід первинної фотохімії (при t = 0) ( Fv/Fm), реакційний центр поглинаючого потоку (RC/ABS), реакційний центр для захопленого енергетичного потоку (при t = 0) (RC/TRo), потік переносу електронів на один реакційний центр (при t = 0) (ETo/RC) та реакційний центр розсіяної енергії (при t = 0) (RC/Dio) 25, 26 .
Проточна цитометрія
Мікроскопічні аналізи
Аналіз даних
Відсоток біомаси, фотосинтезу, розміру клітин, зернистості клітин, активності естерази, окисного стресу та проникності мембран для кожної концентрації AgNP, основного Ag та іонного Ag були нормалізовані до контрольної групи. Дані аналізували за допомогою тесту Даннета та відмінностей при p 35 та AgNP 36 з полімерним покриттям .
Біомаса Chlamydomonas reinhardtii після впливу наночастинок срібла (AgNP) протягом шести днів. Стовпчики представляють стандартне відхилення середнього значення шести повторень. Зірочки (*) вказують на суттєво різні значення порівняно з контрольними значеннями (р 37, інактивація реакційного центру 38, 39 та внесок у більший редукційний показник якості до Q ° у фотосистемі II 39). Площа була найбільш чутливою кінцевою точкою серед кінцевих точок фотосинтезу (Таблиця Хоча фотосинтез водоростей не оцінювався в попередніх дослідженнях на ґрунтах, оброблених AgNP, деякі дослідження повідомляли про інгібування фотосинтезу C. reinhardtii у відповідь на покритий діоксидом вуглецю AgNP 1, дев'ять типів покритого AgNP 21 та інший AgNP 40, 41 у рідкому середовищі, обробленому AgNP.
Морфологія клітин (розмір та зернистість) Chlamydomonas reinhardtii після впливу наночастинок срібла (AgNP) протягом шести днів. Стовпчики представляють стандартне відхилення середнього значення (n = 6-12). ( A ) Гістограма проточної цитометрії та ( B ) Крива контурної цитометрії. Зірочками (*) позначені результати, які суттєво відрізняються від результатів контролю (стор
Легкі мікрофотографії Chlamydomonas reinhardtii після впливу наночастинок срібла (AgNP) протягом шести днів. ( A ) C. reinhardtii, адсорбований на необробленому грунті, B ) C. reinhardtii, адсорбований на 50 мг обробленого AgNP ґрунту/кг, ( C. ) C. reinhardtii, суспендовані в необроблених екстрактах грунту, D ) C. reinhardtii, суспендований у 50 мг AgNP/кг оброблених екстрактів ґрунту, Е ) C. reinhardtii, суспендований в необроблених екстрактах грунту після фарбування нігрозином та ( F ) C. reinhardtii, суспендований у 50 мг AgNP/кг оброблених екстрактів ґрунту після фарбування нігрозином. Чорні стрілки позначають частинки грунту. Сині стрілки вказують на слизькі випадки.
Повнорозмірне зображення
Зображення електронного мікроскопа з випромінюванням полів Chlamydomonas reinhardtii після впливу наночастинок срібла (AgNP) протягом шести днів. ( A ) C. reinhardtii, адсорбований на необробленому грунті, B ) C. reinhardtii, адсорбований на 20 мг обробленого AgNP ґрунту/кг, ( C. ) C. reinhardtii, адсорбований на 50 мг обробленого AgNP ґрунту/кг, ( D ) C. reinhardtii, суспендовані в необроблених екстрактах грунту, Е ) C. reinhardtii, суспендований у 20 мг AgNP/кг оброблених екстрактів ґрунту та ( F ) C. reinhardtii, суспендований у 50 мг AgNP/кг оброблених екстрактів ґрунту. Сині стрілки позначають слизові піхви, виготовлені зі стінки водоростей, а червоні стрілки - фрагменти слизової оболонки.
Повнорозмірне зображення
Електронно-емісійна електронна мікрофотографія (FE-TEM) та енергетично дисперсійні рентгенівські спектроскопічні детектори (EDX) зображень Chlamydomonas reinhardtii у ґрунті, обробленому 50 мг AgNP/кг. ( A ) FE-TEM. ( B ) Зображення EDX демонструють розподіл елементів Ag, S, C, N та O у червоному пунктирному квадраті, накресленому розширеною мікрофотографією FE-TEM з панелі А. C. ) Спектр EDX показує елементний аналіз (C, N, O, S та Ag, як показано синіми кружечками над жовтими піками). Жовтий пунктирний прямокутник вказує на наявність Ag у C. reinhardtii .
Повнорозмірне зображення
Вплив ґрунтів AgNP на проникність мембрани водоростей, активність естерази та окислювальний стрес
Проникність клітинної мембрани ( A a B ), естеразна активність ( C. a D ) та окислювальний стрес ( Е a F ) Chlamydomonas reinhardtii після впливу наночастинок срібла (AgNP) протягом шести днів. Стовпчики представляють стандартне відхилення середнього значення (n = 6-12). Зірочками (*) позначені результати, які суттєво відрізняються від результатів контролю (p PVP-покриті AgNPs> частинки Ag мікрочастинки 58, 59. Вони вказали, що механізмом токсичності є відносна площа поверхні та іони Ag, розчинені в Ag nano. У цьому дослідженні, відсутність значного розчинення іонів Ag з обробленого AgNP ґрунту та слизу C. reinhardtii, суспендованих у ґрунтових екстрактах 50 мг Ag/кг та 30 мг іона Ag/kg, чутливість до токсичності іонів Ag була вищою, тоді як чутливість до маси Ag токсичність була нижчою Отже, ми робимо висновок, що токсичність C. reinhardtii в обробленому AgNP ґрунті залежить виключно від розміру частинок (нано), а не від Ag загалом.
висновки
Нарешті, є кілька вимірюваних ефектів AgNP на ґрунтові водорості C. reinhardtii в ґрунтовому середовищі: (i) утворення слизової оболонки, (ii) інгібування біомаси, (iii) часткове інгібування фотосинтетичної активності, (iv) збільшення розміру клітин, (v) збільшення розміру клітинної мембранної проникності та (vi) наявність Ag в клітинах водоростей. Оскільки виробництво та споживання AgNP продовжує зростати, важливо з’ясувати можливі наслідки подальшого вивільнення AgNP у навколишнє середовище. Таким чином, це дослідження демонструє новий та ефективний метод оцінки токсичності наноматеріалів для ґрунтових водоростей.
Дякую
Це дослідження було підтримано базовою науково-дослідною програмою через Національний дослідницький фонд Кореї (NRF), що фінансується Міністерством науки, ІКТ та планування майбутнього (2016R1A2B3010445). Цю роботу також підтримав Корейський інститут навколишнього середовища та технологій (KEITI) в рамках "Проекту розвитку хімічної аварії", що фінансується Міністерством навколишнього середовища Кореї (МНС) (№ 2016001970001). Ми вдячні Корейському інституту наук (KBSI) за FE-TEM, аналізатор площі поверхні, FE-SEM, EDX та ICP-MS. Особлива подяка Мірі Чой та Мьонг Сон Чон за допомогу в аналізі FE-TEM.
Електронний додатковий матеріал
Додаткова інформація
Коментарі
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.