реферат
Головний
Повнорозмірне зображення
Ми досліджували розподіл ізоферменту РКА (рис. 1в). У Cc, мутантних Ct - m та RI та трансфектантах рівень PKA-I збільшився у 1,5 рази, не змінюючи рівні PKA-II. У RII та трансфектантах рівень PKA-I знизився на 40%, а рівень PKA-II подвоївся. Трансфектанти RII p та RII p-P суттєво знизили рівень PKA-I (до 25% від рівня батьківських клітин) і подвоїли PKA-II. Таким чином, надмірна експресія R1a або C7 не могла придушити експресію PKA-II, тоді як надмірна експресія RIIa, RIIp або RIIp-P значно зменшила експресію PKA-I, що свідчить про сприятливу продукцію PKA-II порівняно з PKA-I (Otten and McKnight, 1989, Otten та ін., 1991; Нестерова та ін., 1996; Лі та ін., 1999). Примітною знахідкою є те, що мутантний RIa-P, на відміну від RIa дикого типу, може пригнічувати PKA-II (малюнок 1c, RIa-P), як раніше було показано в інших ракових клітинах (Lee et al., 1999). до більш високої спорідненості C a до мутантного Ria-P, ніж до Ria, RIIa або RIIp (Lee et al., 1999).
Клітини RII p та RI α-P показали збільшення апоптотичних ядер (рис. 1d та e). Крім того, ці клітини знижували регуляцію антиапоптотичного білка Bcl-2; регульовані проапоптотичні білки Bax, Bak і Bad; і посилення поганого гіпофосфорилювання (рис. 1f), що вказує на те, що сприяння апоптозу, оскільки погане фосфорилювання веде до антиапоптозу (Harada et al., 1999).
Ми досліджували властивості росту трансфектантів гена субодиниць РКА in vitro та in vivo. У моношаровій культурі трансфектанти RIIp та R1a-P демонстрували 80% інгібування росту, а трансфектанти RIIa та RIIP-P демонстрували незначне інгібування росту (рис. 1g). На відміну від них, трансфектанти R1a, Cc - m, C a або лише векторні рослини зростали з тією ж швидкістю, що і швидше, ніж клітини батьківського контролю. Крім того, на моделі оголеної миші ріст пухлини in vivo значно зменшувався лише у трансфектантах RIIp та RI α-β (рис. 1h).
Інгібування росту пухлини in vivo, яке спостерігається у трансфектантах RIIp та RI α-β, корелювало зі змінами їх морфології клітин у культурі клітин in vitro. Нетрансфіковані батьківські клітини показали морфологію круглої форми, показуючи переважно велике ядро з невеликою цитоплазмою, і зростали шляхом накопичення (рис. 1j). Значні зміни в морфології клітин відбулись у клітинах RII β та RI α-β. Ці клітини виявляли великий або тривалий плоский фенотип, який нагадував плоский ревертант, описаний раніше (Noda et al., 1985). Обидві клітини показали збільшену цитоплазму та менше ядро, що призвело до збільшення співвідношення цитоплазми до ядра та м'яко зростало (рис. 1j). Усі інші трансфектанти - Ca, Cc - m, RIIa, RIIa та RIIp - P - мали морфологію, подібну до парентеральних неінфекційних агентів (рис. 1j).
Повнорозмірне зображення
Північний аналіз генів, змінених у клітинах PC3M, трансфікованих генами PKA C та RII p. Загальну клітинну РНК готували з парентеральних та трансфікованих клітин PC3M з використанням набору Rneasy Midi Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), електрофорезу, блотування нейлонової мембрани та піддавали аналізу блотерну (Nesterova et al., 1996). Дані представляють один із двох незалежних експериментів, які дали подібні результати. Специфічні фрагменти кДНК, що відповідають відповідним генам, були отримані за допомогою ПЛР. TGFBR3, трансформуючий фактор росту, бета-рецептор III; AKT2, вірусний онкогенний гомолог 2 тимоми миші v-act; ММР-1, матриця металопротеїнази 1; RBBP2, білок, що зв’язує ретинобластому 2; PAI2, інгібітор активатора плазміногену, тип II; AOE372, пероксидаза тіоредоксину
Повнорозмірне зображення
Таким чином, РІІ-індуковане обернення пухлини може включати дерегуляцію клітинного циклу, що веде до зупинки клітинного циклу, а також індукції апоптозу (рис. 1d-f). На диво, кластер генів, що беруть участь у диференціації клітин, був індукований у клітинах, що експресують RII-β-ре-експресію, і ці гени були незмінними в клітинах, що репресують С18 (рис. 2в та 3). Нещодавнє дослідження геномного аналізу генів, націлених на CREB, виявило потребу в ядерному промоторі для чутливості до цАМФ (Conkright et al., 2003). Не виключено, що гени диференціації, індуковані в β-клітинах RII, можуть бути мішенями для β-опосередкованої індукції генів RII (Srivastava et al., 1998), прямо чи опосередковано через CRE/CREB. Подальша характеристика цих генів диференціації проливає світло на механізм сигналізації РКА при апоптозі/диференціюванні клітин пухлини.
Ці результати показують, що R 1α- та С-репресивні клітини, що містять надрегульований PKA-I, продемонстрували зміни в профілі експресії генів, які були протилежними таким у клітин R-p-ре-експресуючих клітин, що містять переважно PKA-II. Таким чином, мікрочипи кДНК виявили позитивні та негативні сигнали цАМФ для росту пухлинних клітин, індукованих диференціальною експресією регуляторних субодиниць РКА.
Далі ми використовували конфокальну мікроскопію для вивчення внутрішньоклітинної локалізації Cp та RIIp (рис. 4а). Батьківські клітини та клітини з надмірно вираженими клітинами Cα-, R1a та R1- та -P-продемонстрували всі забарвлення Cα (зелене) та RIIB (червоне), яке було виключно цитоплазматичним; C і RII p були колокалізовані, як показано на зображенні накладання (жовте). У цих трансфектантах мало клітин демонстрували одне чітке місце фарбування C та RII p, яке було жовтим у накладці та підтверджувалось переглядом ділянок у ядрі. Крім того, клітини R1- та -експресії експресують забарвлення Cα та RIIβ, зосереджене у перинуклеарній області, тоді як клітини, що надмірно експресують R1a-β, демонструють збільшення забарвлення RIIβ по всій цитоплазмі та в видимому центрі, що організовує мікротрубочки.
Повнорозмірне зображення
Р-репресивні клітини RII виявилися збільшеними. Присутніх було менше клітин, що є однією з них. Найголовніше, що в цьому накладанні думки α і RII p видаються повністю колокалізованими. Ця субклітинна колокалізація RIIp та C7 не обмежувалась апоптотичними клітинами RIIp. Коли β-клітини RII, за відсутності обробки Zn 2+, експресували лише обмежену кількість RII β (транскрипція, керована LTR (Нестерова та ін., 1996)), де клітини проапоптотизували, колоналізація C a та RII також спостерігається (рис. 4b), що вказує на те, що колокалізація Ct-RIIp запобігає апоптозу клітин. Таким чином, послідовності надмірної експресії RIIβ Cc в голоферменті з RIIp блокують активацію C та призводять до зміненої сигналізації cAMP у цих клітинах. Дивно, але сильне фарбування Cα та RII ß було інвагіновано в ядро, що підтверджено розрізом ділянки, який знаходився в ядрі, а не поблизу нього, або через інвагінацію ядерної мембрани. Ця фізична блокада C a, спричинена RII ß в ядрі клітини, може пояснити принаймні частково суперечливий профіль експресії трансфектантів C і RII β, виявлений ДНК мікрочипами. Клітини, які надмірно експресували RIIp-P або RIIa, виявляли фарбування Ca і RIIP, імітуючи батьківські клітини, але не клітини, що експресують RIIp-ere-.
обговорення
У нашому дослідженні ми надмірно експресували дикі та мутантні форми регуляторних та каталітичних субодиниць РКА у клітинах раку простати PC3M та порівнювали вплив на утворення ізоцимів, морфологію клітин, проліферацію клітин, експресію генів та фенотип пухлини. Функціональна характеристика мутації, що зв’язує цАМФ, у типу PKA типу I була широко вивчена (McKnight et al., 1988), тоді як функціональний аналіз субодиниць RI та сайту псевдофосфорилювання (Taylor et al., 1988) майже не вивчався (Durgerian and Тейлор)., 1989, Lee et al., 1999). Ми використовували RI та мутанта R1a - P, який отримує ділянку автофосфорилювання (ala → ser) точковою мутацією G → T (Durgerian and Taylor, 1989; Lee et al., 1999) для функціональної імітації RII. Ми також використовували мутант RII β, RII β-P, у якого відсутня ділянка автофосфорилювання (ser → ala) за допомогою мутації точки T → G (Budillon et al., 1995). Для С та мутантів ми використовували мутант, який не містив N-кінцевий міристат, Cc-m, який був таким же активним, як дикий тип С, і активував РКА в клітині (Clegg et al., 1989), тоді як у на відміну від дикого типу Cpa не має здатності секретувати в позаклітинний простір (Cho et al., 2000).
Наші результати показали, що клітини RIIa-, RIIp- і RIIp-P надмірно експресують PKA-II і майже повністю скасовують PKA-I, тоді як клітини R1a-, C7- і C7-m-надмірної експресії підвищують PKA-I, але я не можу придушити PKA- II. Найголовніше, що клітини, що надмірно експресують RIa-P, функціональні міметики RII, збільшують PKA-I і помітно знижують PKA-II. Показано, що PKA-II є більш переважною формою голоферменту PKA порівняно з PKA-I (McKnight et al., 1988). Одноточкова мутація R1a в місці взаємодії R і C, тобто в місці псевдофосфорилювання (Taylor et al., 1988), дала PKA-I (RIa-P, що містить PKA-I), функціонально імітуючи PKA-II і, як результат, його надмірна експресія пригнічує ендогенний РКА-II.
Наші результати класичного біохімічного аналізу, мікрочипів ДНК та конфокальної мікроскопії підтверджують, що каталітична C-субодиниця PKA, пов'язана з регуляторною субодиницею RIa і утворює голофермент PKA-I, схильна до активації в клітині, викликаючи активацію найрізноманітніших генів, що сприяють росту пухлинних клітин; на відміну від цього, коли субодиниця С поміщається в клітку в комплексі голоферментів РКА-II через зв'язування з регуляторною субодиницею RIIp, активація С-субодиниці обмежена, що призводить до придушення росту пухлини та індукції зворотного фенотипу.
Одним із найбільш захоплюючих аспектів голоферментної системи РКА є здатність клітини підтримувати два типи кінази в клітині - РКА-І і РКА-ІІ - і захищати субодиницю С від виникнення субодиниці R. На початку канцерогенезу РКА-I збільшується зі збільшенням рівня аденилатциклази та цАМФ у клітині (див. Boynton and Whitfield, 1983). Зрозуміло, що порушення співвідношення PKA-I-PKA-II у клітині є ненормальним/небезпечним сигналом, який може спричинити такі захворювання, як рак. Таким чином, наше сучасне дослідження припускає, що перемикання ізоферменту протеїнкінази А, індукуючи диференціальну сигналізацію цАМФ в клітині, може забезпечити генну терапію на основі PC3M простати-пухлини-мішені та інших видів раку.
Дякую
Дякую Шеріл Пеллерін з компанії Palladian Partners, Inc., яка надала редакційну підтримку Національному інституту раку за контрактом N02-BC-76512/C2700212.