- предметів
- реферат
- вступ
- результат
- Структурне визначення пор лізеніну
- Архітектура збірки лізеніну
- Будова Р-циліндра
- Взаємодія з ліпідами
- Перехід до стану, введеного в мембрану
- обговорення
- методи
- Виробництво та очищення рекомбінантних білків
- Тест на гемоліз
- Збірка пір лізеніну
- Підготовка зразків та збір даних
- Обробка зображення
- Створення та вдосконалення моделей
- Підготовка зразка оксиду графену
- прирости
- Банк даних електронної мікроскопії
- Банк даних білка
- Додаткова інформація
- Файли PDF
- Додаткові зображення
- відео
- Додатковий фільм 1
- Коментарі
предметів
- Кріоелектронна томографія
- Надмолекулярне складання
реферат
Лізенін з целомічної рідини дощового хробака Eisenia fetida належить до сімейства аеролізинів дрібних β-пороутворюючих токсинів (β-PFT), деякі з яких є патогенними для людини та тварин. Незважаючи на зусилля, структура цієї групи білків з високою роздільною здатністю була невловима, і тому механізм активації та вставки в мембрану залишається незрозумілим. Тут ми визначаємо порову структуру лізеніну за допомогою кристалічного ЕМО з однією частинкою з роздільною здатністю 3,1 Å. Вимірювальний вузол виявляє довгий ß-циліндровий канал, який виходить за межі довжини комплексу і який несподівано містить два волокна перед введенням, що вистилає гіпотетичну петлю вставки мембрани. Обстеження інших членів сімейства аеролізинів виявляє високу структурну збереженість у цій області, що дозволяє припустити, що шлях доставки мембрани в цій родині підтримується. Для деяких токсинів протеолітична активація та видалення пептиду сприятиме розвитку попередньо вставлених волокон, дозволяючи їм утворювати β-ствол каналу.
Лісенін, захисний білок плоду дощового черв'яка Eisenia, виробляється в темоцитах у рідинах, що утворюють частину імунної системи Землі 1. Він є членом сімейства аеролізинів β-пороутворюючих малих токсинів (β-PFT), які містять ключові фактори вірулентності великої кількості бактеріальних патогенів, таких як аеролізин, що продукується Aeromonas spp 2, Clostridium perfringens epsilon токсин 3 та Α-токсин Clostridium septicum 4, тоді як параспорин-2 Bacillus thuringiensis має цитоцидну активність проти ракових клітин людини 5. Незважаючи на низьку послідовність гомології структури, їх водорозчинні мономерні форми виявляють, що всі вони мають структурно збережений домен, званий пороутворюючим модулем (PFM), який, як відомо, сприяє порі 6-циліндра.
Як і більшість ПФТ, лізенін секретується як неактивний, водорозчинний мономер 7. Після зв’язування зі сфінгомієліном (SM) в мембрані еукаріотичних клітин токсин зазнає суттєвих змін у своїй вторинній структурі 8 і утворює олігомерні пори на поверхні мембрани, як було визначено електронною кристалографією 9 та високошвидкісною атомно-силовою мікроскопією 10, 11, до до вставки в мембрану для утворення пор та подальшого лізису клітин 12, 13 .
Кристалічна структура мономерного лізеніну показала, що токсин організований у два основні структурні домени: (1) подовжений ПФМ на N-кінці, який містить ділянку зв'язування SM, а також петлю вставки мембрани, яка довгий час вважалася область; яка реорганізується в β-шпильку під час вставки мембрани, та (2) С-кінцевий домен бета-трефол, який кристалізувався, зв’язаний з фосфохоліном (POC) 9. Вивчення структури SM-зв’язаного мономерного лізеніну показало, що для зв’язування токсинів необхідні як основна POC-група, так і один кінець SM-ацильної ланцюга.
Хоча в минулому було виявлено кілька структур для мономерних форм токсинів із сімейства аеролізинів 2, 3, 5, 9, 14, 15, 16, 17, 18, атомна структура для їх активних порних форм не вказана. Тут ми представляємо структуру лізеніну в неамериканській вмонтованій у мембрану кріо-ЕМ формі з одиничними частинками з роздільною здатністю 3,1 Å. Структура надає перший погляд на атомну роздільну здатність мембранно вставленого члена сімейства аеролізинів та надає інформацію про те, як інші члени цього сімейства можуть бути активовані та зібрані у свої відповідні форми пір.
результат
Структурне визначення пір лізеніну
Поверхневе зображення заточеної 3,1 Å карти лізеніну, показаної збоку ( a ) та позаклітинні види ( b ). Щільності бічних ланцюгів добре видно на порі ß-циліндра. Повідомляється про три домени субодиниці лісеніну: β-шпилька (оливкова), шапка (рожева) та рецептор-зв'язуючий домен (блакитний). Репрезентативна кріоелектронна мікрофотографія комплексів лізеніну на оксиді графена ( c ), отримані при розмитті -2,3 мкм на FEI Titan Krios з детектором Summit Gatan K2. Характерні середні значення 2D класу олігомеру лізеніну ( d ). Шкала, 20 нм.
Повнорозмірне зображення
Архітектура збірки лізеніну
Мультфільм ілюстрація лізину, що відображається збоку ( a ) та позаклітинні види ( b ). Три домени лісеніну забарвлені, як на малюнку 1: β-шпилька (оливкова), ковпачок (рожевий) та рецептор-зв'язуючий домен (блакитний). Розміри комплексу та пір показані як вимірювання Cα-Cα, а приблизне розташування бішару нанесено на групи фосфоліпідних голів, позначені помаранчевим кольором, а гідрофобне ядро - сірим. Ароматичні кільця Phe70 і Tyr79 перераховані в рядку, як і залишки гістидину безпосередньо над кільцем Tyr79. Залишки сайтів зв'язування фосфохоліну (РОС) відображаються у вигляді сфер, а зірочка позначає гнучку котушку, що з'єднує домен зв'язування рецептора з домом шапки. ( c ) Поверхня зображення відфільтрованого гауссовим покриттям миючого засобу (фіолетового кольору) навколо загостреної карти лізеніну. d ) Уважний погляд на позаклітинну сторону пояса миючих засобів, яка виділяє три залишки гістидину.
Повнорозмірне зображення
Будова Р-циліндра
Взаємодія з ліпідами
Раніше мономерний лізенін кристалізувався, зв’язаний з лігандами SM та POC 9, хоча ці структури були явно у водорозчинному стані. POC кристалізувався, зв’язаний із C-кінцевим доменом β-трилистя лізеніну в кишені, фланкированной Lys185, Ser227, Gln229, Tyr233 і Tyr282 (посилання 9). У формі пір лізеніну ця кишеня ідеально розташована для взаємодії з фосфатидилхоліном або головними групами SM, оскільки вона лежить на кінчику домену, що зв’язує рецептор, безпосередньо над мембраною клітини-мішені (рис. 2а, "POC"). SM був ідентифікований зв’язаним з N-кінцевим PFM, а залишки, які взаємоділи з SM в мономерній структурі (Lys21, Tyr24, Tyr26, Gln117 та Glu128), поховані в пориному домені лізеніну (додаткове зображення 4d). Крім того, ми не виявили додаткових ліпід-відповідних щільностей на симетризованій карті С9 або в асиметричній реконструкції лізеніну 4, 2 Å. Можливо, розпізнавання SM на цьому місці відбувається до олігомеризації та вставки в мембрану, як уже було запропоновано 9. Також можливо, що високі концентрації миючого засобу, що використовується для ефективного вилучення пір з ліпосом, можуть дисоціювати будь-які пов'язані молекули ліпідів з альтернативного ділянки зв'язування SM в порі лізеніну.
Перехід до стану, введеного в мембрану
На малюнку 3 та додатковій плівці 1 показано структурне розташування між розчинною мономерною структурою (рис. 3а) та її олігомерним станом, вбудованим у мембрану (рис. 3b). Підвісна пружна котушка між Val157 та Arg159 (рис. 3a, b, сфери) обертає N-кінцеву кришку
20 Å (рис. 3c) і обертається всередину до середнього просвіту на 35 ° (рис. 3d). Вертикальний колапс відповідає спостереженням AFM за лісеніном на площинних двошарових шарах, які виявили зменшення висоти до 3 нм при введенні в мембрану 10. Цей рух індукує вигин в середині відносно плоскої доменної кришки розчинного мономеру (рис. 3b, штрихові лінії) і призводить до того, що кожна доменна шапка розташована у верхній частині домену сусідньої субодиниці, що зв’язує домен рецепторного супроводу 1). Β-шпильки вимагають повного перетворення 5 β-ниток та 3 10 спіралей мономеру PFM-лізеніну 9 у 2 нові β-волокна, як показано на малюнку 3a, b. Β-шпилька починається біля позаклітинної сторони просвіту пір та кривої у напрямку до внутрішньоклітинної сторони майже на 270 ° (рис. 3d). Таким чином, пори лізеніну з B-циліндра складаються втричі більше поліпептиду, ніж вважалося спочатку (24 залишки) 9 .
a ) Мультиплікаційне зображення мономеру лізеніну (PDB ID 3ZXD) та його мембранного стану ( b ) з обома молекулами, вирівняними щодо домену, що зв'язується з рецептором, у зазначеній орієнтації (вставлено). Штрихові лінії vb вказують на згин в області ковпачка, а залишки шарнірів (Val157 - Arg159) відображаються як сфери. Колірна схема показана на фіг. 2a з позначеними N- та С-кінцями. Зображення жорсткого накладеного водорозчинного мономеру (блакитний) та його форми, вбудованої в мембрану (оливкова) щодо домену, що зв'язує рецептор, як видно збоку ( c ) та позаклітинний вигляд ( d ). Зірочки вказують на Ser31 в обох структурах. Показано падіння висоти на 20 Å та обертання на 35 ° у напрямку до просвіту дому кришки.
Повнорозмірне зображення
обговорення
Кріо-ЕМ структура пір лізеніну з роздільною здатністю 3,1 Å 315 кДа являє собою першу структуру пор з атомною роздільною здатністю для члена малого сімейства аерозолів β-PFT, що виявляє перехід водорозчинного мономеру на його вбудовану в мембрану поверхню, олігомерний стан. Структура забезпечує основу для майбутніх досліджень того, як інші члени цієї родини можуть досягти утворення пор, і відкриває шлях для розробки нових терапевтичних засобів, спрямованих на функціональне порушення утворення пор для цієї родини.
Порівняння водорозчинної мономерної структури лізеніну з трьома іншими членами сімейства аеролізинів. Передбачувані ділянки, що сприяють 3-циліндрам в аеролізині (1PRE), токсині епсилону (3ZJX) та параспорині-2 (2ZTB), забарвлені в зелений колір для раніше передбачених мембранних петель і жовтий для попередніх волокон для обтиску, визначених тут. вивчення. У сукупності ці області утворюють β-циліндр пори лізеніну. Два волокна перед введенням зазвичай розташовані на краю токсинів і ізольовані від основного тіла (сірі). У випадку аеролізину та епсилон-токсину волокна попереднього введення беруть участь у β-листах з CTP (червоним), стабілізуючи тим самим розчинний мономерний стан. У параспорині-2 N-кінцевий пептид, якого не було в кристалічній структурі активованого токсину, мав найбільший вплив на активність токсину і, як вважалося, взаємодіє з петлею введення, тим самим діючи як запобіжник .,
Повнорозмірне зображення
Метод введення мембрани лізеніну, визначений у цьому дослідженні, подібний до методу введення сімейства α-гемолізину малих βPFT. Гемолізини стафілококів та токсин клостридії NetB зазнають простого подовження області перед стеблом, яке вставляється проти β-сендвіч-домену, утворюючи пори β-циліндра без істотних змін в решті структури 23, 25, 26 35. Цей механізм надзвичайно зберігається в цьому сімействі, навіть коли області симетрії, стехіометрії субодиниць та області зв'язування рецепторів відрізняються 27. Подібним чином волокна попереднього введення лізеніну розмотуються з ПФМ і розташовуються у довгому β-циліндрі. Однак, на відміну від α-гемолізину, ліфен PFM зазнає конформаційних змін, що призводить до колапсу
20 Á та внутрішнє ущільнення (додаткова плівка 1). Модель пор для аеролізину, запропонована Degiacomi та співавт. Та PFM (домени 3 та 4), розташована подібно до лізеніну. Однак подовження β-шпильок аеролізину може розпочатися, як у випадку з лізеніном, у верхній частині ПФМ і може включати волокна попереднього введення. Коли більш пористі структури сімейства аеролізинів будуть вирішені з високою роздільною здатністю, буде зрозуміліше, як ці токсини змінюються і наскільки збережені механізми вставки.
На основі наших висновків та попередньої роботи в даній області техніки модель утворення пір лізеніну, показана на фіг. 5. Початкове зв'язування розчинних мономерів з мембраною буде опосередковуватися через рецептор-зв'язуючий домен з основними групами РОС (рис. 5а) (посилання на 9 та це дослідження). Крім того, це допомагає зорієнтувати токсин до утворення пор. На цьому етапі також може бути визнано SM. Це буде супроводжуватися олігомеризацією до попереднього стану (рис. 5b), як ідентифікується AFM 10, 36 та електронною кристалографією 9, шляхом взаємодії мономер-мономер, що може спровокувати розвиток β-волосків до нижчого енергетичного стану . і дозволити більш щільну упаковку мономерів. Олігомеризація, етап, який є обов’язковим до утворення пор для всіх p-PFT, що характеризуються на даний момент, забезпечує наявність достатньої кількості β-шпильок для формування каналів 9 та задовольняє гідрофобне середовище, таке як водневий зв’язок для β-волокна, напр у вигляді ліпідного бішару 37. Нарешті, утворення β-циліндра формує пори в бішарі (рис. 5в), що призводить до порушення мембранного гомеостазу і, зрештою, до лізису клітин.
( a ) Мономери лізеніну (PDB ID 3ZXD) спочатку зв'язуються з клітинною мембраною-мішенню через взаємодію між рецепторно-зв'язуючим доменом та основними частинами POC. ( b ) Після зв’язування з мембраною збільшення місцевої концентрації мономерів сприятиме олігомеризації, що призведе до попереднього збирання пор. Залежно від орієнтації мономерів, висота попередньої пори може становити до 100 Å (довжина мономеру лізеніну). ( c ) Навантажена мембраною форма лізеніну, розчинена в цьому дослідженні, поширюється на 65 Å над поверхнею мембрани. Гіпотетична попередня пора, показана тут, була побудована шляхом вбудовування дев'ятикратної симетрії в мономерну кристалічну структуру, розташовану за посиланням на рецептор-зв'язуючий домен у формі, вбудованій у мембрану.
Повнорозмірне зображення
методи
Виробництво та очищення рекомбінантних білків
Тест на гемоліз
Збірка пір лізеніну
Підготовка зразків та збір даних
Зразки занурювали в заморожування з використанням звичайно виготовленого поршня при 4 ° C. Олігомери лізеніну (3 мкл 0,2 мг мл -1) висівали на мідь із круглою сіткою Quantifoil R1.2/1.3 (Quantifoil Micro Tools, GmbH) шаром квадратної сітки (Quantifoil Micro Tools, GmbH), покриту оксидом графена (див. нижче), і залишали прилипати протягом 30 с. Потім сітки змивали зі зразка на 10 секунд, а потім занурювали в рідкий етан. Зразки були зображені на просвічувальному електронному мікроскопі FEI Titan Krios, що працює при прискорювальній напрузі 300 кВ. Мікрофотографії записували у режимі високої роздільної здатності з використанням прямого електронного детектора Gatan K2 Summit на кінці енергетичного фільтра Gatan Quantum в режимі нульових втрат та ширини щілини з вибором енергії 20 еВ. Загальна доза у зразку становила 47 е - до Å2, фракціонована на 20 зображеннях з каліброваним розміром пікселів 0,715 Å для мікрофотографій високої роздільної здатності.
Обробка зображення
Створення та вдосконалення моделей
Кристалічна структура 9 лізеніну дикого типу (PDB ID 3ZXD) була використана як шаблон для моделювання de novo кінця N після залишків С-кінця 150, які утворюють рецептор-зв'язуючий домен β-трилистя. Всі побудови моделей виконувались в Coot 45. У моделі відсутні 9N-кінцеві залишки, для яких ми не могли бачити щільності. Доопрацювання моделі для поліпшення підгонки, геометрії та зіткнень атомів було проведено за допомогою REFMAC 5.8 (посилання 46) з некристалографічними обмеженнями симетрії для врахування дев'ятикратних обмежень симетрії та вторинної структури, створених PROSMART 47. Перехресна перевірка параметрів уточнення, що використовуються для уникнення надмірного припасування, була проведена шляхом уточнення моделі щодо першої нефільтрованої половинної карти та порівняння FSC тієї самої моделі проти обох напівкарт (Додаткова Рис. 4b).
Підготовка зразка оксиду графену
Дисперсію оксиду графену в H 2 O (Sigma) розбавляли до 0,2 мг мл -1 в H 2 O і пряли при 300 г протягом 30 с для видалення великих агрегатів. Сітчасті сітки Quantifoil R1.2/1.3 розряджали протягом 1 хв, а 3 мкл суспензії графена додавали до сіток протягом 1 хв. Нещодавно сітки були коротко промокані за допомогою фільтрувального паперу Whatman No1 і тричі промивали по 20 мкл крапель H 2 O (двічі на графеновій стороні і один раз на зворотній стороні). Потім сітки використовували для глибокого заморожування без подальшої обробки.