предметів

реферат

Головний

Хондрогенні клітини-попередники (КЗК), такі як клітини насіння хряща, важливі для підтримки гомеостазу хряща. 1, 2 СРС вперше були виявлені в литковому хрящі як субпопуляція клітинних поверхневих зон, які, як було встановлено, необхідні для апопозиційного росту в суглобовому хрящі. 3 Келлінг та ін. 1 також виявив CPC в суглобовому хрящі на пізніх стадіях остеоартриту людини (ОА). Ці клітини-попередники мігрують до місцевих місць пошкодження, де вони розмножуються та диференціюються за необхідності для заміщення пошкодженої тканини. 2 Мезенхімальні стовбурові клітини-попередники значно розширюються і можуть диференціюватися на безліч ліній, включаючи кістки, хрящі, сухожилля, м’язи та нервові клітини, за певних умов культивування in vitro. Зниження функції м’язових стовбурових клітин вважається потенційною основною причиною зниження здатності старіючих ссавців підтримувати скелетну м’язову тканину. 4 Той самий ефект спостерігався в хрящовій тканині. Таким чином, пригнічення функції СРС може бути фактором ризику розвитку ОА.

Ми виявили, що медіатори запалення ОА, виявлені в синовіальній рідині, викликали дегенерацію нормального суглобового хряща при введенні в непошкоджені порожнини суглобів собак бігль. Серед цих запальних цитокінів лептин представляв особливий інтерес, оскільки він впливає на гомеостаз маси тіла та значну і позитивну кореляцію між лептином та дегенерацією хряща. Лептин, який продукується білою жировою тканиною, - це невеликий (16 кДа) неглікозильований білок, кодується геном Ob. Лептин та його рецептори були виділені з людських хондроцитів, остеофітів, синів та жирових інфузійних прокладок. 9, 10

Stannus OP та ін. надано докази того, що рівні лептину в сироватці крові незалежно та послідовно пов’язані зі зменшенням товщини хряща, як у поперечному перерізі, так і в поздовжньому, що свідчить про те, що лептин відіграє важливу роль в етіології та розвитку ОА. 8 Сімопулу та ін. 11 також виявив, що експресія лептину та рецепторів лептину (Ob-Rb) була значно вищою у хрящах хворих із розвиненим ОА, ніж у хрящах хворих з легким ОА. Крім того, протеоглікани в суглобовому хрящі виснажувались, коли лептин вводили в колінні суглоби щурів. Попередні дослідження вивчали вплив лептину на біологічні функції хондроцитів. Однак механізми, що опосередковують дегенерацію хряща, спричинену лептином, точно не визначені. Дослідження впливу лептину на біологічні функції СРС збільшило б наше розуміння ролі лептину в деградації хряща.

Тут ми виділили та ідентифікували CPC із хряща колін щурів. Лептин змінив диференціювання CPC шляхом інгібування хондрогенезу та посилення остеогенезу. Лептин також індукував старіння в CPC, активуючи шлях p53/p21 та інгібуючи шлях Sirt1. Активація лептинового шляху (вищі рівні Ob-Rb) суттєво корелювала з дегенерацією хряща (нижчі рівні Coll-2) та старінням тканин (вищі рівні p53/p21 та нижчі рівні Sirt1) при ОА. Разом наші результати виявляють нові взаємозв’язки між ожирінням та пошкодженням хряща, які спричинені опосередкованим лептином ефектом на поведінку клітин, старіння та внутрішньоклітинну сигналізацію.

результат

Ідентифікація СРС, виділених із хряща

лептин

Повнорозмірне зображення

Високі дози лептину зменшують міграційні здібності, пригнічують хондрогенний потенціал та збільшують остеогенний потенціал КПК.

Повнорозмірне зображення

Лептин підвищує рівень p53, ацетильований p53, p21 та Sirt1 під час старіння CPC

Два основних шляхи ведуть до індукції клітинного старіння: p38-активована мітогеном протеїнкіназа (MAPK)/p16 INK4a та p53/p21-cip-шляхи. Рівні фосфорильованого p38 MAPK в CPC були трохи вищими в клітинах, вирощених у присутності фізіологічних та високих доз лептину, ніж у контрольних клітинах. Однак рівні р53, ацетильованих р53 та р21 були значно вищими в клітинах, які отримували високі дози лептину, ніж у контрольній групі. Нижчі рівні деацетилази пірту Sirt1 часто асоціюються із старінням, опосередкованим р53. Експресія Sirt1 була значно нижчою в клітинах, оброблених високими дозами лептину, ніж у контрольних клітинах, а рівні ацетильованого р53 також були вищими в цих клітинах. Лептин може викликати старіння CPC, активуючи шлях p53/p21 та інгібуючи Sirt1.

Лептин індукує старіння в CPC, активуючи шлях p53/p21

Ми провели серію аналізів інгібування шляху для подальшого вивчення ролі шляху p53/p21 у старінні CPC. CPC обробляли високою дозою лептину та або інгібітором p38 SB203580, або інгібітором p53 PFT-α, і аналізували ефекти їх інгібування (рис. 4а). Старіння клітин оцінювали шляхом визначення відсотка SA-β-Gal-позитивних клітин. Інгібітор p38 SB203580 не мав явного впливу на відсоток SA-β-Gal-позитивних клітин, однак клітини, оброблені інгібітором p53-PFT-α, показали значно нижчий відсоток забарвлених SA-β-Gal клітин (Рисунки 4b) . і в). І інгібітори р53, і Р-р38 не змогли збільшити відсоток старечих клітин. Ці результати вказують на те, що лептин індукує старіння в CPC, активуючи шлях p53/p21.

Блокада шляху p53/p21 інгібує старіння у лікуваних лептином CPC. ( a ) Інгібітор р38 SB203580 (10 мкМ) суттєво знижував експресію Р-р38. Інгібітор p53-PFT-α (20 мкМ) значно знижував експресію p21. ( b a c ) Відсоток SA-β-Gal-позитивних клітин значно зменшився після обробки клітин PFT-α та 100 нг/мл лептину, але не після обробки клітин SB203580 та 100 нг/мл лептину протягом 48 годин. представляють середнє значення ± шкала SD, 100 мкм. * P # P> 0,05 означає, що результати не були статистично значущими

Повнорозмірне зображення

Індукція старіння CPC лептином через інгібування шляху Sirt1 21/p53

Щоб підтвердити, що шлях Sirt1 бере участь у спричиненому CPC лептині, старіння, ми дослідили ефект активації Sirt1 та блокади. Ми виявили, що коли клітини обробляли високою дозою лептину (100 нг/мл) та ресвератролу (30 мкМ), активатора Sirt1, експресія ацетилу p53 була нижчою, ніж у контрольних клітинах, і що відсоток SA-β-Gal -позитивні клітини зменшились до 25% (малюнки 5b та c). Цей результат вказує на те, що активація Sirt1 запобігає спричиненому лептином старіння в CPC і що лептин індукує старіння, інгібуючи шлях Sirt1. Щоб визначити, чи стимулює лептин інгібування Sirt1 сприяє старінню в хрящових тканинах, ми підготували суглобову хрящову тканину з колін тримісячних мишей Sirt1 KO (Sirt1 -/-) (через місяць після нокауту) для вивчення ефекту Sirt1 KO на виразів p53 та p21. Миші Sirt1 -/- демонстрували значно вищі рівні p53/p21, ніж їх природні посліди у відділах хрящової тканини (малюнки 5e та f). Ці результати підтверджують, що лептин індукує старіння в CPC, інгібуючи шлях Sirt1 та активуючи шлях p53/p21, що може погіршити підтримку гомеостазу хрящової тканини та призвести до старіння хряща.

Активація та блокування Sirt1 вплинули на старіння CPC через індукований лептином шлях p53/p21. ( a a b ) Клітини обробляли ресвератролом та лептином та аналізували відсоток SA-β-Gal-позитивних клітин. Культивовані CPC обробляли ресвератролом (30 мкМ), агоністом шляху Sirt1 та 100 нг/мл лептину. ( c ) Через 48 годин лікування вестерн-блот-аналіз показав, що експресія ацетильованого р53 була пригнічена. ( d ) ПЛР-аналіз геномного локусу Sirt1 у гетерозиготних флокс-мишей з тамоксифеном та без нього. ( e a f ) Порівняння кількості p53 та p21 позитивних клітин у мишей дикого типу та KO. Зображення флуоресцентної мікроскопії показують, що шлях p53/p21 був більше активований у суглобових хрящових тканинах мишей Sirt1 KO, ніж у мишей дикого типу. Шкала, 100 мкм. Смужки помилок вказують середнє значення ± SD * P

Ми використали специфічний маркер, CD146, для позначення CPC, 14, 21, і виявили, що клітини-попередники були в основному розподілені по поверхневому шару (рис. 1в). Цей результат узгоджується з результатами попередніх досліджень. Ці результати дозволяють припустити, що CPC можуть бути присутніми в матриксі суглобового хряща, якщо вони не активуються певними станами, такими як травма та запалення, які вимагають відновлення пошкоджених хрящових тканин. 5

Крім того, наші дослідження показали, що високі дози лептину пригнічують проліферацію (малюнки 3а та b) та індукують зупинку клітинного циклу в CPC. Зупинка клітинного циклу зазвичай призводить до відпочинку або старіння. 19 Спокій - це оборотний процес, що призводить до перехідного стану клітинного спокою. І навпаки, старіння веде до незворотних змін нормальної клітинної діяльності. Вперше клітинне старіння спостерігалось у старих клітинах, але може траплятися і в молодих клітинах. Старі клітини продовжують рости і здаються більшими, ніж їх нестаріючі аналоги. Гіпертрофія, пов’язана зі старінням, призводить до збільшення кількості та активності лізосом - ознаки, яка використовується в одному з найбільш широко використовуваних аналізів для ідентифікації старіння, SA-β-Gal, який базується на активності лізосомної β-галактозидази. 15, 28

Ми спостерігали збільшення відсотка SA-β-Gal-позитивних CPC, коли клітини вирощувались у присутності високих доз лептину in vitro (Рисунки 3c і d). Ці дані вказують на те, що лептин індукує старіння в CPC. Два основних шляхи ведуть до індукції клітинного старіння: p38-активована мітогеном протеїнкіназа (MAPK)/p16 INK4a та p53/p21-cip-шляхи. Ми показуємо, що рівні p53, ацетильованих p53 та p21 були значно вищими у CPC, оброблених лептином, ніж у контрольних CPC (рис. 3e та f). Активація p53 може призвести або до сприяння апоптозу, або до індукції старіння. Мікросхема p21 - це контролер клітинного циклу, який має вирішальне значення для визначення результату активації p53, оскільки він індукує зупинку клітинного циклу, пригнічує проапоптотичну активність p53 і каналізує активність p53 для стимулювання старіння. Після блокування шляху p53/p21 відсоток SA-β-Gal-позитивних клітин був значно нижчим у CPC, оброблених лептином + PFT-α. На відміну від цього, не спостерігалося явної зміни відсотка SA-P-Gal-позитивних клітин у клітинах, оброблених інгібітором лептину + P-p38, хоча рівні P-p38 у цих клітинах були нижчими, ніж у CPC, які отримували лише лептин. (Рисунки 4b та c). Ці результати вказують на те, що лептин активує шлях p53/p21 для індукування старіння CPC.

Sirt1 часто асоціюється з опосередкованим р53 старінням, оскільки він знижує рівень деацетилази р53 і стабілізує р53, 30, що має шкідливі ефекти, що зменшують функцію р53. Активація Sirt1 за допомогою ресвератролу показала, що сигналізація Sirt1 бере участь у старінні, спричиненому лептином, у CPC (рис. 5b та c). Ми також виявили, що зрізи суглобової хрящової тканини, отримані від мишей Sirt1 KO до віку 3 місяців, виявляли вищі рівні p53 та p21, ніж у порівнянних зрізах, отриманих від мишей WT (малюнки 5e та f). Інгібування шляху Sirt1 та активація шляху p53/p21, мабуть, мають синергетичний ефект на старіння в CPC, що включає дегенерацію хряща та OA.

Втрата нормальної функції, яка виникає внаслідок індукції старіння, пов’язана з віковими захворюваннями та дегенерацією тканин. 31, 32, 33 Порівнюючи хрящові тканини, зібрані з одного і того ж колінного суглоба ОА, що демонстрували різні рівні дегенерації, ми виявили, що рівень лептину був однорідним і що вплив лептину був змінним. Ми спостерігали більш важку дегенерацію в хрящових тканинах (низька експресія Coll-2) з вищою експресією Ob-Rb (яка активує шлях лептину), вищою експресією p53/p21 (що спричиняє старіння тканин) і нижчою експресією Sirt1 в тому ж колінному суглобі ( Малюнки 6a ab). Наші дані підтверджують існування взаємозв'язку між Ob-Rb та Coll-2, шляхом p53/p21 та шляхом Sirt1 (малюнки 6d-f), а також уявлення про те, що спричинене лептином старіння викликається в CPC через активацію p53. шлях p21 та інгібування шляху Sirt1. Ми також показуємо, що ці процеси можуть в більшій мірі залежати від функції Ob-Rb у пацієнтів з ОА та можуть бути важливим фактором, що сприяє розвитку ОА. Ці результати також пояснюють, чому більше розрідження спостерігається в медіальному хрящі великогомілкової кістки під час дегенерації хряща 8, що супроводжується збільшенням експресії Ob-Rb (рис. 6а).

ІМТ або відсоток жиру в організмі показує відносне збільшення у деяких людей із збільшенням віку, а також рівень лептину також має тенденцію до зростання з віком. Наші результати показують, що підвищений рівень лептину може згубно впливати на функцію СРС і може прискорити дегенерацію хряща. Контроль ваги може бути важливим засобом профілактики ОА. Однак чи може бути порушено старіння, спричинене лептином, при СРС та дегенерації хряща та чи підвищені рівні експресії Ob-Rb, що спостерігаються при важкій дегенерації хряща, викликані біомеханічними силами, потребуватимуть подальших досліджень.

висновки

Коротко кажучи, лептин змінює долю диференційованих КПК, пригнічуючи хондрогенез та посилюючи остеогенез. Лептин індукує старіння в CPC, активуючи шлях p53/p21 та інгібуючи шлях Sirt1. Активація лептинового шляху (вища експресія Ob-Rb) суттєво корелює з дегенерацією хряща (нижчі рівні Coll-2) і старінням тканин (вищі рівні p53/p21 і нижчі рівні Sirt1) у пацієнтів з ОА, що свідчить про те, що лептин-індукований CPC значення старіння сприяє розвитку ОА. Загалом, наші результати свідчать про нові зв’язки між ожирінням та пошкодженням хряща, які включають опосередкований лептином вплив на диференціацію та старіння СРС.