Понеділок, 3 січня 2011 р
Методи класифікації дріжджів
ХАРАКТЕРИСТИКИ, ЩО ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ У КЛАСИФІКАЦІЇ ДРЖЖЖ
- Мікроскопічний вигляд клітин.
- Режим статевого розмноження.
- Фізіологічні характеристики (особливо харчові).
- Біохімічні характеристики.
- Порівняння геномів шляхом повторної асоціації ДНК-ДНК або ДНК-РНК
Таксономія: Класифікація та ідентифікаційне дослідження.
Класифікація: Групування організмів у таксони (таксони) відповідно до їхніх родових подібностей чи взаємозв’язків, або обох.
Ідентифікація: Порівняння між невідомим штамом та подібним відомим.
Номенклатура: назва прийнятого таксону.
МІКРОСКОПІЧНИЙ АСПЕКТ
Розмір комірки.
Форма: форма клітин вказує на вегетативний спосіб розмноження.
Формування ниток
Статеве розмноження Будова і форма аскоспор і теліоспор
ФІЗІОЛОГІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Здатність ферментувати певні цукри (тест на бродіння).
Аеробне зростання за допомогою різних сполук (асиміляційні тести), кожна з яких є єдиним джерелом вуглецю або азоту.
Розщеплення арбутину.
ТЕХНОЛОГІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Вивчення сили бродіння.
Температура інкубації для тестів таксономії становить 25 ° C, хоча оптимум для одних дріжджів вищий, а для інших нижчий.
МЕТОДИ КЛАСИФІКАЦІЇ ДРЖЖЖ
Спосіб: Спороутворення викликається культивуванням дріжджів у сприятливому середовищі (середовищі передспороношення), багатому глюкозою, в якому вони залишаються протягом 48 годин при 28 ° С. Через цей час їх висівають у середовище спороношення (середовище спороутворення), бідне глюкозою, щоб максимально зменшити вегетативне розмноження, та доповнюють речовиною, що індукує спороношення, наприклад ацетатом. В останньому середовищі вони зберігатимуться від 3 до 5 днів при температурі 25 ° C. Після закінчення цього періоду інкубації готують свіжі препарати з подальшим мікроскопічним спостереженням, відмічаючи наявність або відсутність спор, а також їх розмір. Щоб полегшити це спостереження, фарбування спор можна робити у сумнівних випадках.
У випадках негативного спороношення культури зберігають при кімнатній температурі та досліджують щотижня мінімум від 4 до 6 тижнів.
Склад ЗМІ:
Преспоруляційне середовище
Глюкоза 50 г.
Дріжджовий екстракт 10 гр
Поживний бульйон (Difco) 30 г.
Калій ацетат
Агар 20 г.
Вода 1000 мл
Спорифікаційне середовище:
Глюкоза 1 г.
Дріжджовий екстракт 2,5 г.
Поживний бульйон (Difco)
Калій ацетат 9,8 г.
Агар 20 г.
Вода 1000 мл
Перед трубками середовище потрібно розтопити, оскільки воно містить агар.
Стерилізація середовища проводиться в автоклаві в одній атмосфері протягом 15 хвилин.
Потужність бродіння є мірою відсотка (об/об) етанолу, який штам дріжджів здатний виробляти.
Цей тест був спочатку розроблений Хейдюком і описаний Герикстотом та Оштровським у 1927 році. Він заснований на визначенні шляхом втрати ваги вуглекислого газу, який виділяється під час спиртового бродіння, згідно зі стехіометричним рівнянням:
C2H12 06 ——-———— 2 CO2 + 2 CH3-CH2OH
Метод: Для визначення сили бродіння виноградне сусло Боме 12º готують із концентрованого сусла, доводячи рН до 5 за допомогою розчинів гідроксиду натрію або соляної кислоти.
Приготовлене таким чином середовище розподіляють по 100 мл колбах Ерленмейера. ємність, поклавши в кожну по 50 мл середовища. Їх стерилізують в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин.
Посів проводять платиновою ручкою молодих культур, після посіву сусла колби закривають гумовими пробками, оснащеними клапанами Мюллера з концентрованою сірчаною кислотою. Ці клапани дозволяють вихід вуглекислого газу і перешкоджають надходженню повітря.
Після посіву колби зважують і інкубують при 25 ° С. до постійної ваги.
Отримана різниця ваги в кінці процесу буде вказувати на виділений вуглекислий газ, помножений на встановлений коефіцієнт, безпосередньо дає значення етанолу, що утворюється у відсотках (об/об).
Розрахунок коефіцієнта:
При ферментації 180 г глюкози вони виробляють 88 г вуглекислого газу і 92 етанолу; отже, один грам СО2 відповідає 1,04 г етанолу. Оскільки щільність етанолу дорівнює 0,79, 1,04 г відповідає обсягу 1,3 с.е. Отже 1 г СО2 відповідає 1,3 с.
Різниця у вазі в грамах, помножена на 1,3, дає обсяг виробленого етанолу.
Об’єм сусла ———————— 1,3 х втрата ваги = г етанолу
100 ————————————————— PF
Об'єм сусла становив 50 мл. незабаром:
PF = 100 x 1,3 x втрата ваги в грамах: 50
П.Ф. = 2,6 х втрата ваги в грамах.
На практиці його множать на 2,5, оскільки врожайність не дорівнює 100.
Результат цього тесту надає важливу інформацію про ідентичність досліджуваного штаму.
Таксономісти не розглядають цей тест, проте в Інституті промислових ферментацій було помічено, що цей тест швидко визначає рід і всередині нього, в деяких випадках роду Saccharomyces дозволяє розрізнити різні види. Невключення цього тесту може бути пов'язано з тим, що виноградний сусло не є головним джерелом вивчення дріжджів, як це відбувалося в цьому інституті майже з його походження.
ФОРМУВАННЯ ПСЕВДОМІЧЕВИХ ФІЛІЙ
Спосіб: Абсорбуючий папір кладуть у чашку Петрі, а зверху - зігнуту скляну паличку, на яку кладуть предметне скло. Набір стерилізують у духовці при температурі 120 ° С протягом 3 годин. Після стерилізації та роботи в асептичних умовах на предметне скло наносять кілька крапель стерильного розтопленого солодового агару з утворенням тонкої плівки. Коли середовище тверде, його висівають з молодої культури (48 годин на солодовому агарі) платиновим дротом, роблячи поздовжню смугу та кілька дуже легких поперечних ліній. На папір наливають стерильну воду, щоб підтримувати високий ступінь вологості всередині пластини.
Можливі наслідки можна виявити шляхом безпосереднього спостереження під мікроскопом після інкубації при 25 ° C через 15 і 30 днів після посіву. Можна побачити такі утворення, як хламідоспори, бластоспори та артроспори. Важливість цього тесту більша у випадку штамів, що не містять спор.
Залежно від форми та розташування бластоспор можна виділити кілька типів псевдоміцелію:
- Тип Mycandid. З круглими або подовженими бластоспорами і більш-менш розгалуженими.
- Тип мікоторули. З круглими бластоспорами та з осьовим розташуванням у муточках, що нагадують круглі клітинні скупчення.
- Тип бластодендрію. З видовженими та розгалуженими бластоспорами в мутовках.
ФОРМУВАННЯ ЗАВІТИ
Властивість утворювати вуаль на рідкому середовищі проявляється у численних видів дріжджів.
Хоча завуальованість, здається, тісно пов'язана з потребою дріжджів у кисні, ферментативні дріжджі можуть завуальовуватися так само, як неферментаційні дріжджі. Хоча такі фактори, як склад середовища, форми контейнера, вік, кількість посівного матеріалу є важливими для його утворення.
Таксономічне значення цього тесту не є важливим, але воно є ще однією інформацією для характеристики виду.
Спосіб: Для вивчення формування завіси дріжджі висівають у виноградну сусло 8 ° Бауме.
Виноградне сусло 8 ° Baumé готується шляхом розведення в дистильованій воді концентрованого виноградного сусла високої якості або отриманого зі свіжого винограду. Нагріти до кипіння і фільтрувати гарячим за допомогою сиропного фільтра, потім довести рН до 5. Дати охолонути і процідити через сиропний фільтр.
По 10 мл дозують у кожну з 16 пробірок розміром 160 мм.
Знову його стерилізують в автоклаві при половині атмосфери протягом 30 хвилин. Таким чином ми маємо прозорий і стерильний сусло, підготовлене до сівби.
Зазначений посів здійснюється шляхом пропускання петлі кожної молодої культури протягом 48 годин до трубки виноградного сусла, виконуючи цю операцію в двох примірниках.
Інокульоване середовище витримують протягом місяця при температурі 21 ° C ± 1.
Перше спостереження проводять через два дні після посіву.
Результати записуються наступним чином:
Наявність завіси зі знаком V.
Наявність острівців зі знаком I.
Наявність кільця зі знаком А.
Відсутність завіси зі знаком VN.
Знак S призначений для випадків, коли в суслі видно дріжджовий осад, а знак T, при якому спостерігається сильна каламутність і виділення бульбашок.
ФЕРМЕНТАЦІЯ ЦУКРІВ
Здатність дріжджів ферментувати цукру спостерігається шляхом культивування досліджуваних штамів у рідких розчинах досліджуваних цукрів.
Склад використовуваних носіїв такий:
Бакто-дріжджі-азот-основа (Difco) 6,7 г.
Тест на цукор 20 г.
Дистильована вода 1000 мл
Спосіб: Підготовлені середовища розподіляють у пробірках із розрахунку 9 мл на пробірку, оснащену дзвоном Дарема; і стерилізують в автоклаві при 121 ° C (одна атмосфера) протягом 15 хвилин. Посів проводять з молодих культур (48 годин в агармальті), їх інкубують у печі при 28ºC протягом 15 днів. Тест вважається позитивним, якщо після інкубації у витяжці з’являється газ.
Випробовувані цукри: глюкоза, галактоза, мальтоза, сахароза, лактоза та рафіноза.
Випадок рафінози заслуговує на особливу увагу. Носії, що відповідають штамам, що дають позитивні результати у ферментації цього цукру, піддають паперовій хроматографії, щоб з'ясувати, яка саме сполука після розщеплення рафінози залишається вільною в середовищі.
Після хроматографії можуть бути три випадки:
- Мелібіоза або сахароза залишаються вільними. Бродіння 1/3
- Галактоза залишається вільною. Бродіння 2/3
- Ніяких слідів цукру не з’являється Бродіння 3/3
АСІМІЛЯЦІЯ ЦУКРІВ
Асиміляція цукрів полягає у визначенні цукрів, які досліджувані штами дріжджів можуть окислительно метаболізувати. Оскільки весь ферментований цукор також засвоюється, цей тест проводять лише з тими цукрами, до яких штам не ферментований.
Склад використовуваних носіїв такий:
Бакто-дріжджі-азот-основа (Difco) 6,7 г.
Тест на цукор 1 г.
Агар 20 г.
Дистильована вода 1000 мл
Посів проводять, починаючи з молодої культури (48 годин у солодовому агарі), суспендованої у фізіологічній сироватці. Вміст цієї суспензії виливають у пробірки нахиленими засобами досліджуваних цукрів таким чином, що вся поверхня середовища просочується посівним матеріалом, а потім надлишок суспензії викидається. Висіваючі таким чином пробірки інкубують при 28 ° C протягом 15 днів, після чого наявність росту на поверхні середовища свідчить про позитивну реакцію, тоді як його відсутність вважається негативною.
Інший спосіб проведення цього тесту - використання ауксонографічного методу. Цей метод проводиться на пластинах, і кожна з них може бути перевірена на декілька цукрів одночасно.
Використаним середовищем є:
Бакто-дріжджі-азот-основа (Difco) 6,7 г.
Агар 20 г.
Дистильована вода 1000 мл
Його стерилізують в автоклаві при 121 ° С протягом 15 хвилин, потім дають охолонути до 45 ° С і розподіляють по пластинах, в яких суспензію досліджуваних штамів попередньо поміщають у фізіологічний розчин, перемішують для гомогенізації та дозволяється затвердіти. Абсорбуючі паперові диски, просочені стерильними розчинами цукрів, що досліджуються на 2% у дистильованій воді, поміщають на інокульоване середовище. Пластини інкубують при температурі 28 ° C протягом 3-4 днів, а потім спостерігають, чи відбулися ореоли зростання, і в цьому випадку тест вважається позитивним.
АСИМІЛЯЦІЯ НІТРАТІВ
Це перевірка використання нітратів аеробно як джерела азоту дріжджами.
Два носії, використані в цьому тесті, мають такий склад:
Середній 1
Дріжджово-вуглецева основа (Difco) 11,7 г.
Нітрат калію 0,78 г.
Агар 20 г.
Дистильована вода 1000 мл
Середній 2
Дріжджово-вуглецева основа (Difco) 11,7 г.
Агар 20 г.
Дистильована вода 1000 мл
Спосіб: Посів в обох випадках проводять непрямим способом, починаючи з молодої культури (48 годин в агармальті), суспендованої у фізіологічній сироватці. Вміст цієї суспензії розливають по пробірках із нахиленим досліджуваним середовищем таким чином, що вся поверхня середовища просочується посівним матеріалом, а потім надлишок суспензії викидається. Після висівання пробірки інкубують протягом 15 днів при 28ºC. Через цей час порівнюють кожну з культур, що належать до одного мікроорганізму, спостерігаючи, чи сприяла присутність нітрату калію чи ні посівного штаму. У тому випадку, якщо ріст більший у середовищі, що містить нітрат, ніж у тій, що не має його, результат вважається позитивним. Коли ніякої різниці не оцінено, вона зазначається як негативна, оскільки вплив нітратів вважається нульовим.
ВИКЛЮЧЕННЯ АРБУТИНИ
Розпад арбутину є підтверджуючим тестом активності ß-глюкозидази у штамах дріжджів.
Застосовуване середовище має такий склад:
Арбутин 5 г.
Дріжджовий екстракт 1 г.
Агар 20 г.
Дистильована вода 1000 мл
Спосіб: Після розчинення середовища на водяній бані його розподіляють у пробірки, до яких попередньо додавали краплю розчинної залізної солі (1% хлориду заліза у дистильованій воді). Їх стерилізують в автоклаві при температурі 121 ° C протягом 15 хвилин, а потім нахиляють для затвердіння.
Посів проводиться стриями з молодих культур, інкубуючи в духовці при температурі 28 ° С протягом 15 днів. Зручно залишити незасіяну трубку в однакових умовах, щоб виступати в ролі контролю.
Тест вважається позитивним, коли спостерігається зміна кольору щодо контрольної пробірки після росту дріжджів, оскільки у випадках, коли арбутин гідролізується, утворюється вільний хінон, який при реакції з розчинною залізною сіллю, присутньою в середовище дає темно-коричневе забарвлення.
Це молекулярні методи, засновані на аналізі фрагментів молекул нуклеїнових кислот, найбільш широко використовуються електрофорез каріотипу, мікросупутниковий аналіз, поліморфізм довжини мітохондріальної ДНК, поздовжній поліморфізм рестрикційних фрагментів рибосомної РНК, поліморфізм випадково ампліфікованої ДНК та аналіз низькомолекулярна РНК.
Молекулярні методи ідентифікації дріжджів та мікроорганізмів загалом засновані на вивченні молекул ДНК та РНК.