свиней

  • реферат
  • Головний
  • Свині як експериментальна модель
  • Кістозний фіброз
  • Пігментний ретиніт
  • рак
  • Створення свиней за допомогою генної інженерії
  • NSRRC
  • імпорт
  • Виведення та моніторинг стану здоров'я
  • Розподіл зразків та живих тварин
  • Генетично модифіковані власні моделі, створені PI
  • кріоконсервація
  • Дослідження та дослідження за окрему плату
  • висновки

реферат

Свині стають все більш важливими як біомедична модель. Через схожість між свинями та людьми, краще розуміння основної біології людського здоров’я та хвороб може спричинити свині, а не класичні моделі гризунів. Зі зростанням потреби в свинячих моделях важливо, щоб геномні інструменти, моделі та послуги були доступні науковому співтовариству. Багато з них доступні через Національний центр ресурсів та досліджень свиней (NSRRC), який фінансується Національним інститутом охорони здоров’я США при Університеті Міссурі. NSRRC націлений на надання високоякісних моделей біомедичних свиней науковому співтовариству.

Головний

Генетично модифіковані моделі тварин дозволили безпрецедентний прогрес у біомедичних дослідженнях. Багато організмів використовуються для отримання генетично модифікованих моделей, таких як миші, щури, вівці, велика рогата худоба 1 та свині 2. Усі ці види надали інформацію, цінну для розуміння біології, що лежить в основі, а також патогенезу багатьох захворювань людини. Однак деякі моделі мають обмеження у своїй здатності рекапітулювати захворювання чи синдром людини. Наприклад, миші та щури не є оптимальною тваринною моделлю для вивчення людського ока чи проведення ортопедичної хірургії через обмеження розміру їх очей чи кісток та суглобів. Крім того, класичні моделі гризунів не завжди повністю рекапітулюють захворювання людини, такі як муковісцидоз (МВ) 3. .

Свині мають багато переваг перед іншими видами як біомедична модель і вважаються оптимальною моделлю для ксенотрансплантації, оцінки ризику забруднення навколишнього середовища та виявлення наркотиків. Багато в чому свиня більш схожа, ніж у інших моделях, з точки зору анатомії, фізіології та патофізіології; філогенетично свині на рівні нуклеотидів знаходяться втричі ближче, ніж миші 4. В даний час ми маємо величезну кількість інформації про свиней після її використання в сільському господарстві, що охоплює всі аспекти її анатомії та фізіології, починаючи від основних генетичних реакцій навколишнього середовища і закінчуючи прикладними аспектами, такими як житло 5. Крім того, ми маємо змогу застосувати багато досягнень медичних технологій, розроблених для людей, до моделі свиней, таких як магнітно-резонансна томографія та сканування позитронно-емісійної томографії, а на свинях регулярно проводиться хірургічне навчання. У цьому огляді ми обговоримо значення свиней як біомедичної моделі, а також геномні інструменти та послуги, такі як NSRRC, які доступні для полегшення його використання в дослідженнях здоров’я людини та захворювань.

Свині як експериментальна модель

Незважаючи на те, що це відмінна модель у своєму природному стані, найбільший ефект від свиней у біомедичному співтоваристві, ймовірно, буде від її ролі як моделі генної інженерії для конкретного захворювання людини. Тут ми обговоримо три випадки, коли генно-інженерні свині виявилися вигідними моделями.

Кістозний фіброз

CF - це аутосомно-рецесивний розлад, спричинений мутацією гена CFTR, який регулює транспорт аніонів. Приблизно у 70% людей з CF мутація CFTR є делецією трьох пар основ, кодуючих амінокислоту 508 (фенілаланін) білка CFTR 3. Деякі симптоми МВ включають закупорку слизу (меконієвий ілеус), закупорені протоки підшлункової залози, затверділий жовчний міхур та захворювання легенів 3. Коли ген CFTR мутується на моделі миші, аніонний канал не функціонує, але класичних симптомів CF не спостерігається. Однак, коли модельною твариною є свиня з мутацією людини (тобто видалення фенілаланіну 508), у 100% поросят спостерігаються класичні симптоми МВ, включаючи меконієву кишку, ураження печінки та захворювання легенів 3. Сучасна модель свиней використовується для інвазивного дослідження захворювань легенів для розробки нових методів лікування.

Пігментний ретиніт

Моделі свиней відіграють домінуючу роль у дослідженнях пігментного ретиніту (RP) 11. RP є аутосомно-домінантним розладом людини, при якому поширена форма захворювання виникає в результаті заміщення гістидином амінокислоти проліну в положенні 23 (P23H) у гені RHO. РП характеризується настанням нічної сліпоти, втратою периферичного зору, а потім втратою центрального зору 12. У 2012 році Росс та ін. 13 розробили інбредну мініатюрну модель свині для RP, яка повторювала фенотип людини. Трансген людини з мутацією P23H в гені RHO людини був випадковим чином введений в геном свині і отримано низку фенотипів13. Хоча існує декілька інших моделей RP, які рекапітулювали хворобу, перевагою свинячої моделі є біологічна схожість між свинею та людським оком. Ще однією перевагою цієї моделі свиней є те, що вроджений мініатюрний генетичний фон свиней сприяє розвитку клітинної терапії. Дослідники можуть вводити велику кількість інокуляту в очі свиням, дозволяючи їм вивчати ефекти клітинної терапії без будь-яких заплутаних наслідків відторгнення 14. Ця модель була використана в декількох експериментах, наприклад, для визначення того, чи може добавка куркуміну зупинити або затримати дегенерацію стрижневих фоторецепторів. .

рак

Рак - це велика колекція захворювань, які, як правило, характеризуються аномальним ростом клітин. Мутації в KRAS становлять близько чверті раку людини, а мутації в p53 - ще третину. Ми розробили індуцибельну модель раку свині з флоксифікованим стоп-кодоном між промотором бета-актину курки та мутантними формами KRAS G1D2 та p53 R172H. Ця модель раку свиней дозволяє індукувати пухлини в будь-якій тканині або органі шляхом введення CRE рекомбінази в потрібну тканину. CRE сприяє рекомбінації між двома сайтами loxP і видаляє стоп-кодон. Видалення стоп-кодону призводить до транскрипції та подальшої трансляції двох генів, що індукують рак. Перша робота in vitro з клітинами, виділеними від тварин-засновників, показала, що трансген був функціональним, коли аденовірус використовувався для доставки Cre до клітин in vitro. Клітинна морфологія, час поділу та час міграції клітин відрізнялись у клітинній лінії моделі раку порівняно з контрольними лініями 16. Крім того, у 12 з 14 мишей, яким вводили клітини адено-Cre-індукованої моделі свинячої карциноми, розвинулися вимірювані пухлини. Нарешті, пухлини індуковані адено-Cre у трьох різних місцях у свиней KRAS G1D2 та p53 R172H 16 .

Створення свиней за допомогою генної інженерії

За останні три десятиліття технології виробництва генетичних модифікацій геному свині значно розвинулися. Історично склалося, що генна інженерія свиней проводилася шляхом додавання трансгенів до випадкових місць у геномі. За допомогою техніки мікроін’єкції геномні конструкції вставляли в зиготи пронуклеусів 17, що призводило до випадкових випадків вставки, які могли спричинити введення мутацій 18. Вставки можуть відбуватися як одна або більше копій трансгену, що інтегруються в одному або декількох ділянках геному. На додаток до випадковості вставки, деякі введені трансгени можуть інтегруватися лише після розщеплення зиготи, тобто під час двоклітинної стадії. Інтеграція під час двоклітинної стадії може відбуватися в різних місцях (або взагалі не) в геномі двох бластомерів, що призводить до мозаїчного зародка та тварини 19. Якщо потомство двох бластомерів по-різному сприяло зародковій лінії, тоді трансген може переноситися на потомство, а може і не. Але навіть з урахуванням цих застережень, трансгенез шляхом введення пруклеарних ін’єкцій все ще є потужним інструментом для виробництва нового білка у свиней.

Останніми і найважливішими досягненнями генної інженерії свиней є використання генно-інженерних технологій, таких як цинк та нуклеази пальців 29, 30, транскрипційні активатор-подібні ефекторні нуклеази 31, 32, 33 та кластеризовані регулярно розташовані короткі паліндромні повтори. Система Cas9 (CRISPR/Cas9) 34. Ці засоби є високоефективними і можуть бути розроблені, щоб не залишати генетичних слідів, таких як маркер, який можна вибрати. Насправді система CRISPR/Cas9 настільки ефективна, що ін’єкція в зиготи (якщо попередньо встановлені окремі CRISPR) може призвести до того, що у всіх нащадків будуть модифіковані алелі 34. Система CRISPR/Cas9 дозволила нам редагувати геном свині, видаливши гени та націлившись на донорські вставки ДНК; він навіть може змінити одну основу в геномі. Завдяки новим методам модифікації генів можна передбачити створення практично будь-якої модифікації або комбінації модифікацій у свиней, таким чином усуваючи будь-які генетичні бар'єри, що залишились, що обмежували їх використання в минулому.

NSRRC

Стіл в натуральну величину

імпорт

Багато дослідників вже розробили моделі для конкретних застосувань. Однак підтримка зв'язку та реагування на запити інших слідчих може бути важкою для незалежних установ. НСРР може зняти тягар донорів-розслідувачів із тягаря розподілу. Існуючі моделі можуть бути передані в НСРР, де вони будуть зберігатися та надаватися іншим дослідникам. Слідчі можуть подарувати модель NSRRC за умови, що модель може вільно розповсюджуватися серед інших слідчих у неприбуткових установах. Донор-дослідник надав НСРРР необхідну інформацію про модель, таку як генетична модифікація (якщо така є), фенотип, передбачувані запити на рік на лінію, стан здоров’я та стан штаму. Потім НСРР визначить, чи буде прийнята подарована модель до центру. Після прийому слідчий та НСРР тоді визначать типовий план пожертв. Типові пожертвування здійснюються або через заморожені зразки, такі як сперма, збір конкретних типів клітин для клонування або кріоконсервації, або у формі живих тварин, якщо це дозволяє стан здоров'я.

Виведення та моніторинг стану здоров'я

Усі моделі NSRRC розміщені або у звичайному житловому приміщенні, або в нашому спеціальному приміщенні, що не містить патогенів. Моделі, подаровані NSRRC, повторно отримані до одного з цих установ видалення патогенів від донорської установи. Повторне виведення може бути здійснено кількома методами, які можуть включати чисте кесарів розтин, перенесення ембріонів, запліднення або клітини, що використовуються для ядерного перенесення соматичних клітин. Постійний моніторинг тварин у наших закладах до, під час та після повторного виведення гарантує, що моделі в НСРР мають найвищі стандарти охорони здоров’я. Здоров’я контролюється на предмет захворювань, включаючи вірус репродуктивних та респіраторних захворювань свиней, лептоспіри, Mycoplasma hyopneumoniae, цирковірус свиней II та нещодавно вірус свиней та дельта-коронавірус. Тести на інші захворювання розвиваються і розвиваються відповідно до вимог дослідницьких програм головного дослідника (ІП). Прикладом є розробка та підтвердження тесту на цитомегаловірус, оскільки вторинна цитомегаловірусна інфекція може призвести до відмови органів свині, які передаються бабуїну 35. Моніторинг багатьох патогенних мікроорганізмів проводиться з використанням тестів, розроблених НСРР для внутрішнього тестування зразків фекалій, перорального або крові.

Розподіл зразків та живих тварин

Через обмежені можливості та знання свиней у багатьох місцях, НСРР може надавати конкретні зразки без необхідності оновлення існуючої інфраструктури та експертизи. Слідчий може вимагати всі моделі свиней, доступні через НСРР. Моделі можуть бути розподілені як клітини, тканини, органи чи живі тварини. Приклад зразків, розподілених через НСРР, наведено в таблиці 2. Коли дослідник запитує проби, НСРРЦ готує тварин до відбору проб. У випадку зразків, відібраних працівниками НСРР, запитуваному слідчому пропонується надати детальний протокол відбору проб, а також подробиці умов перевезення. Запитуючий слідчий може також взяти зразки особисто, відвідавши установу РНРЦ.

Стіл в натуральну величину

На додаток до зразків, живі тварини можуть бути роздані слідчим, які подали запит. Тварин можна направляти до установ для проведення специфічного тестування, нової терапії або відбору проб. Установи можуть також приймати тварин для створення власної племінної колонії. Живі тварини зазвичай залишають НСРРК найраніше у віці від 4 до 5 тижнів, тому тварин відлучають і починають перед транспортуванням на твердому кормі; однак у деяких ситуаціях можуть перевозити новонароджених. NSRRC буде співпрацювати із слідчим запитувачем та приймаючою установою, щоб визначити найкращий спосіб розподілу тварин та забезпечити, щоб стан здоров'я приймаючої установи не був порушений.

Генетично модифіковані власні моделі, створені PI

Будь-який головний дослідник може вимагати від НСРРР розробки власної моделі свиней. Якщо слідчий фінансується NIH, наразі НСРР може виготовити цю модель безкоштовно для слідчого, який подав запит; однак, після характеристики моделі, вона буде вільно поширюватися. Завдяки тому, що моделі поширюються, виконується зобов'язання політики розподілу NIH щодо гранту NIH PI. Інформаційні організації, які не фінансують NIH, також можуть вимагати власні моделі, але в цих випадках наша модель оцінюється нашим дорадчим комітетом. Необхідна модель повинна відповідати наступним критеріям: вона може використовуватися в декількох дисциплінах і, ймовірно, буде користуватися великим попитом. Якщо Консультативний комітет відхиляє заявку на модель або слідчий бажає обмежити розповсюдження моделі, виробництво може вимагатись на основі оплати послуг. Співробітники NSRRC можуть допомогти у всіх аспектах моделювання, починаючи від проектування та розробки та догляду за тваринами-засновниками. В даний час ми використовуємо засоби модифікації генів (CRISPR/Cas9) для виготовлення багатьох необхідних моделей 34. NSRRC, як правило, виробляє від трьох до п’яти моделей на рік.

кріоконсервація

Плазма від усіх генетично модифікованих тварин та тварин дикого типу зберігається у різних форматах, включаючи ембріони, соматичні клітини та сперму. Кріоконсервація забезпечує NSRRC можливість підтримувати лінії без постійного виробництва, а також запобігати катастрофічним втратам внаслідок спалахів хвороб. Для забезпечення лінійного обслуговування повторювані зразки зберігаються за межами майданчика у вторинному сховищі. Кріоконсервовані зразки можуть бути надіслані запитуваному слідчому для створення тварин на місці в їх установі. Крім того, НСРР може надати слідчому послуги кріоконсервації та зберігання для своєї генетично модифікованої моделі свині; ті, хто не хоче дарувати свої моделі, все ще можуть отримувати послуги, але на основі плати за послуги.

Дослідження та дослідження за окрему плату

НСРР проводить дослідження, які сприятимуть його продуктивності з точки зору виконання своїх функцій. NSRRC проводить дослідження в галузі генної інженерії, переносу ядер соматичних клітин, кріоконсервації та розробки тестів моніторингу здоров'я. Крім того, НСРР допоможе слідчим у їхніх проектах біомедичних досліджень. Співробітники NSRRC та слідчі, які просять запитання, обговорюватимуть проект, щоб визначити, чи можливо NSRRC проводити дослідження на своєму об'єкті. Реалізація дуже вимогливих проектів та проектів, що вимагають вузькоспеціалізованого обладнання, може бути більш вимогливою для НСРР і, можливо, доведеться проводити в установі запитуючої ІМ. Слідчий та НСРР також обговорять бюджет та часові рамки, необхідні для завершення проекту.

висновки

В останнє десятиліття спостерігається значне збільшення використання свиней як зразків для здоров’я та хвороб людини. Незалежно від того, використовуються вони в природному стані чи генетично створені, свинячі моделі стають біомедичною моделлю вибору, значною мірою завдяки зростаючій здатності рекапітулювати різні захворювання людини. Завдяки обмеженому досвіду та обладнання по всій країні, потреба у центральному ресурсному центрі стала пріоритетом. НСРР було створено, щоб служити сховищем цінних моделей свиней для біомедичних досліджень, перекладаючи тягар утримання та розповсюдження моделей свиней з дослідника на національний ресурс. Крім того, НСРР створює та розповсюджує власних свиней, генерованих за моделями ПІ. Ми тут, щоб допомогти спільноті дослідників свиней закласти основу для своїх біомедичних досліджень.