реферат
Головний
Щелепно-лицеві фіброзні ураження складають групу розладів обличчя та щелепи, що характеризуються заміщенням кістки доброякісним сполучнотканинним матриксом з різною кількістю мінералізованих речовин. Осмотична фіброма та фіброзна дисплазія - найпоширеніші ураження фіброзу, які можуть бути пов’язані зі значними косметичними та функціональними розладами; оскільки вони демонструють різні закономірності прогресування захворювання, важливо розрізняти їх. Через ризик рецидиву, оссифікуюча фіброма повинна бути повністю енуклейована з навколишньої кістки. 1, 2, 3 Навпаки, пацієнти з фіброзною дисплазією повинні лікуватися відповідно до клінічного стану. Зростання моностотичної фіброзної дисплазії зазвичай має тенденцію до стабілізації після досягнення скелетної зрілості; Тому операцію у дітей та підлітків слід якнайшвидше відкласти. 1, 2, 3, 4 терапію бісфосфонатами застосовують у пацієнтів із симптоматичною фіброзною дисплазією. Типові випадки окостеніння фіброми та фіброзної дисплазії обличчя та щелепи характеризуються рентгенологічним та гістологічним виглядом. Однак ці ураження часто представляють діагностичну дилему через невизначеність щодо діагностичного значення конкретних рентгенологічних та гістологічних особливостей; Тому точна діагностика цих уражень може бути важкою. 1, 2, 3
Гістологічно стромальні фібробласти продукують кістковий матрикс без морфологічних ознак остеобластичних клітин на периферії кісткових спікул при фіброзній дисплазії. 4 Ультраструктурні та біохімічні дослідження показують, що фібробластичний компонент фіброзної дисплазії пов’язаний з остеогенною лінією; 7, 8, але точних молекулярно-біологічних доказів для цієї мети поки не надано. Нещодавно було показано, що остеогенна диференціація від мезенхімальних стовбурових клітин обумовлена фактором транскрипції Runx2. 9, 10 Отже, відмінності у експресії Runx2 та інших остеогенних маркерів можуть дозволити гістологічну різницю між фіброзною дисплазією та осмотичною фібромою.
У тканинах ураження пацієнтів із синдромом МакКуне-Олбрайта виявлено мутацію в точці активації альфа-субодиниці гена стимулюючого білка G (GNAS) у кодоні Arg201. Згодом мутації GNAS спостерігали при екстрагнатичній фіброзній дисплазії без синдрому МакКуне-Олбрайта, 12, 13, 14, 15, який визнав її маркером фіброзної дисплазії. Однак наявність або відсутність мутацій GNAS при дисплазії фіброзу метаболізму не вивчалась.
У цьому дослідженні ми проаналізували експресію остеогенних маркерів та мутацій GNAS у випадках дисплазії фіброзного комару та окостеніння фіброми з типовими рентгенологічними та гістологічними ознаками для виявлення важливих маркерів, що дозволяють диференціювати дві сутності захворювання.
Матеріали і методи
Експериментальні предмети
Дев'ять зразків фіброзної дисплазії, п'ять - з міоми, що закостеніла, дві - з остеофібріальної дисплазії та три - з нормальних кісток, декальцинировали в розчині ЕДТА, фіксували у формаліні та вкладали у парафін. Зразки тканин, використані в цьому дослідженні, були отримані відповідно до рекомендацій Спільної комісії з клінічних досліджень аспірантури факультету стоматології та медицини Університету Осаки. Дев'ять фіброзних дисплазій включали п'ять моностотичних гнатичних випадків та три моностотичних та однополіостотичних екстрагнатичних випадків. Усі п’ять випадків окостеніння міоми були отримані з області комарів. Всі ці ураження діагностували як типові випадки на основі клінічних, рентгенологічних та гістологічних критеріїв. Клінічні дані, пов'язані з цими випадками, коротко зведені в таблиці 1. Гістологічні зрізи цих зразків, розрізаних на 5 мкм, фарбували гематоксиліном та еозином та піддавали процедурі імунопероксидази.
Стіл в натуральну величину
імуногістохімія
Імуногістохімічне фарбування проводили методом пероксидази комплексу стрептавідин-біотин (sABC) із системою анти-миші або кролика sABC від Dako (Глоструп, Данія). Основними антитілами, використаними в цьому дослідженні, були наступні: мишачі моноклональні антитіла проти Runx2 (MBL Co., Ltd., Нагоя, Японія), 16 кролячих антидентинових матриксних білків 1 (DMP1) поліклональні антитіла, 17 мишачих проти бичачого остеокальцину моноклональні антитіла (клон; OC4-3) (TaKaRa Biomedicals, Shiga, Японія) та кролячі анти-мишачі поліклональні антиостеопонтинові антитіла (IBL Co., Ltd., Gunma, Японія). Відновлення антигену проводили шляхом перетравлення трипсину до імунозабарвленого остеокальцину та DMP1 та нагрівання цитратним буфером до імунозабарвлення Runx2 та остеопонтину. Зрізи трохи контрастували з метиловим зеленим. Сироватку IgG миші або кролика (Dako) використовували як первинне антитіло як негативний контроль, даючи однакові негативні результати.
Поліморфалізм полімеразної ланцюгової реакції - довжина обмеження (PCR-RFLP)
секвенування
Продукти ПЛР з ампліфікацією на 88 п.н., укладені з ПНК-праймером, очищали за допомогою 2% електрофорезу в агарозному гелі. Смуги вирізали та виділили з гелю за допомогою наборів для екстракції ДНК (QIAGEN). Ізольовану ДНК субклонували у вектор pGEM-T Easy (Promega Co, Медісон, Вісконсин, США). Після очищення проводили секвенування з використанням векторних праймерів SP6 і T7. Десять клонів на ураження аналізували за допомогою автоматизованої моделі ДНК-секвенсора 373 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Таким чином, всі продукти, що ампліфікували ПЛР, секвенували для підтвердження присутності мутації.
результат
Клініко-патологічні та рентгенологічні дані пацієнтів
Клінічні дані пацієнтів з фіброзною дисплазією та окостеніючою фібромою наведені в таблиці 1. Дев'ять фіброзних дисплазій та п'ять окостеніючих фібром, представлені як збільшення уражених кісток, та п'ять дисплазій з фіброзним фіброзом та п'ять окостеніючих фібром показали асиметрію обличчя. Рентгенологічно дисплазія з фіброзом комарів показала однорідну радіоактивну непрозорість із перемішуванням шліфованого скла в навколишню нормальну кістку (рис. 1а), тоді як оссифікуюча фіброма виглядала як однокласне змішане радіоактивне та радіоактивне непрозоре ураження з чітко визначеними межами (малюнок 1г). ). Гістологічно дисплазія фіброзу комарів складається з тканинної кістки неправильної форми у васкуляризованій фіброзній стромі мінливого целюліту (рис. 1b та c). Ткані кісткові спікули рівномірно розподілені по всьому ураженню та мають різну форму (рис. 1b та c). Осмотичні фіброми показали видатні кальцифіковані структури (кубики та цементоли), які виглядали як еозинофільні або базофільні остеоїдні або кісткові сфероїди в щільній стромі середньої клітини (рис. 1е та f). Таким чином, у цьому дослідженні використовувались ураження, які відповідали типовим клінічним, рентгенологічним та гістологічним критеріям.
Повнорозмірне зображення
Імуногістохімічні дані фіброзної дисплазії та осмотичної фіброми
Імуногістохімічні дані дисплазії екстрагнатичного та фіброзного комарів та осмотичної фіброми показані на малюнку 2. Як у фібративних дисплазіях, так і в оссифікуючих фібромах, фарбування Runx2 спостерігалося в ядрах клітин веретена у волокнистих сполучних тканинах, а також у клітинах на поверхні мінералізованих клітин. структури (рис. 2а - в). Подібним чином остеопонтин був виявлений по периферії звапнених структур в обох ураженнях (рис. 2г - f). Сильна імунореактивність щодо остеокальцину розподілялася в кальцифікованих структурах при фіброзній дисплазії (рис. 2g та h), тоді як в осмотичній фібромі була помітна лише слабка імунореактивність (рис. 2i). DMP1 був специфічно присутній у кальцифікованому матриксі, що оточує остеоцитоподібні клітини, як у фіброзній дисплазії, так і в осмотичній фібромі (рис. 2j-1). Таким чином, не було значної різниці між фіброзною дисплазією та осмотичною фібромою в розподілі кісткового матриксу будь-якого протестованого білка, крім остеокальцину.
Повнорозмірне зображення
Виявлення мутації GNAS при фіброзній дисплазії та при ізольованих фібромах методом ПЛР-RFLP
Зразки ДНК із нормальної кістки (рис. 3а, смуги 1-3, 7-9) та остеофібріальної дисплазії (рис. 3а, смуги 4, 5, 10, 11) використовували як негативний контроль. 18 Коли ПЛР проводили без PNA, у негативних контролях генерували ампліфікований фрагмент на 88 п.н. Додаючи PNA до ПЛР, інтенсивність ампліфікованих смуг зменшувалась приблизно на 40-60%. Після обробки Eag I ампліфіковані фрагменти 88 п.н. повністю перетравлювались на два фрагменти 74 та 14 п.н., незалежно від того, чи була присутня PNA чи ні (рис. 3а, смуги 1-5, 7-11). Подальший аналіз послідовності не виявив жодної мутації GNAS у цих зразках ДНК (дані не показані).
Повнорозмірне зображення
В якості позитивного контролю використовували зразок ДНК з парафінового блоку екстрагнатичної поліостотичної фіброзної дисплазії (пацієнт №3). За відсутності PNA, нерозщеплені смуги 88-bp і 74-bp, що відповідають мутантам і алелям дикого типу, були видимими після перетравлення Eag1 (Малюнок 3a, смуга 12). У присутності PNA після розщеплення EagI було видно лише нерозрізану смугу 88 п.н., а не розщеплену смугу 74 п.н. (рис. 3а, смуга 6). Ці результати показують селективну ампліфікацію мутантних алелів у присутності PNA. 20
ПЛР-аналіз проводили для чотирьох екстрагнатичних фіброзних дисплазій, п’яти фіброзних фіброзних дисплазій та п’яти осмотичних фібром. У всіх дев'яти випадках екстрагнатичної дисплазії або фіброзу комарів фрагменти 88-bp, перетравлені Eag I, не ампліфікувались (рис. 3b, смуги 1-4: дисплазія екстрагнатичного фіброзу; 5-9: дисплазія фіброзу комарів). Навпаки, обробка Eagle п’ятьма зразками окостеніючої фіброми призвела до повного розщеплення фрагментів 74 і 14 п.н. (рис. 3b, смуги 10-14). Аналіз послідовності виявив мутації GNAS в кодоні Arg201 у всіх дев'яти випадках фіброзної дисплазії, але ні в одному з проб окостеніння фіброми (Таблиця 1).
обговорення
Оссифікуюча фіброма та фіброзна дисплазія часто представляють діагностичну дилему як для лікарів, так і для патологоанатомів через їх рентгенологічну та гістологічну схожість. Войтек та ін. 21 повідомили, що значні осмотичні фіброми повністю не можна відрізнити від фіброзної дисплазії з їх гістологічних досліджень. Ці ураження також продемонстрували значне рентгенографічне перекриття. 21 Вони припустили, що завдяки цій схожості оссифікуючу фіброму та фіброзну дисплазію можна розглядати як захворювання на обох кінцях одного морфологічного спектру. В іншому звіті зазначається, що окостеніння фіброми є різновидом фіброзної дисплазії, а не іншим захворюванням. Це дослідження наочно демонструє, що імуногістохімічний аналіз остеокальцину та ПЛР-аналіз мутацій GNAS є корисними методами розмежування між ними, а крім того, припускає, що вони, ймовірно, можуть бути різними суб'єктами захворювання.
Фіброзна дисплазія гістологічно характеризується стромальними фібробластами, що продукують кістковий матрикс без морфологічних ознак остеобластичних клітин на периферії кісткових спікул. Остеобластична природа цих фібробластичних клітин була запропонована за допомогою аналізу електронної мікроскопії, який показує вистилання аномальних остеобластів з подібним фібробластом навколо незрілої тканини, 7 та біохімічний аналіз, який показує збільшення активності лужної фосфатази в клітинах, які заповнюють фіброзні ділянки. фіброзна дисплазія. У цьому дослідженні ядра клітин фібробластів, а також клітини кісткової поверхні показали сильну експресію Runx2, важливого фактора транскрипції для остеогенної лінії, що свідчить про те, що ці клітини є остеогенними попередниками. Подібним чином клітини фібробластів в оссифікуючій фібромі також демонстрували сильну експресію Runx2 в ядрі. Таким чином, обидва ураження можна інтерпретувати як клітинні захворювання в остеогенній лінії.
Імуногістохімічний аналіз остеогенних маркерів, таких як остеопонтин та DMP1, не показав великої різниці між фіброзною дисплазією та осмотичною фібромою; проте імуногістохімія остеокальцину показала значну різницю між ними. Остеопонтин, остеокальцин та DMP1 - це рясні неколагенові білки нормальної кісткової матриці. 23, 24, 25 Остеокальцин, найпоширеніший неколагеновий білок 24, розподіляється в нормальній кістці 25 і, як було доведено, є негативним регулятором утворення кісток за технологією генного нокауту. Рясність остеокальцину при фіброзній дисплазії та його дефіцит при окостенінні фіброми свідчать про те, що кальцифікований матеріал при фіброзній дисплазії більше схожий на нормальну кістку, ніж при окостенінній фібромі. Ця помітна різниця може свідчити про відмінності у формуванні кісток та диференціації остеобластів між двома ураженнями.
Аналіз мутацій GNAS на кодоні Arg201 виявився корисним для розмежування між оссифікуючим фіброзом та фіброзною дисплазією. Соматичний характер мутацій при фіброзній дисплазії ускладнює їх ідентифікацію, оскільки мутації присутні не у всіх клітинах уражених пацієнтів, навіть в уражених органах. Тому в цьому дослідженні був використаний метод затискання PNA. 15, 20 Секвенування фрагментів, ампліфікованих ПЛР, підтвердило точність ПЛР-аналізу з використанням PNA, припускаючи, що ПЛР-аналіз, використаний у цьому дослідженні, може бути корисним та легко доступним способом виявлення мутацій GNAS в кодоні Arg201. .
Нещодавно були опубліковані зміни гена супресора пухлини HPRT2 в осмотичній фібромі. Безпосереднє секвенування HPRT2 виявило мутації у двох із чотирьох випадків окостеніння міоми. Ці висновки свідчать про те, що мутація HPRT2 не є поширеною при розвитку осифікуючої фіброми і тому не може використовуватися як маркер для діагностики.
На закінчення фіброзна дисплазія та окостеніюча фіброма є подібними захворюваннями, оскільки обидва вони мають маркери, що відповідають остеогенному лінії в їхніх стромальних фібробластоподібних клітинах. Однак вони відрізняються точним складом кісткового матриксу, про що свідчить імуногістохімія остеокальцину. Нарешті, ПЛР-аналіз з PNA на мутації GNAS в кодоні Arg201 є потенційно корисним методом для розрізнення цих двох.