Нормально-фазова хроматографія - це термін, який використовується для розділення молекул за допомогою взаємодії гідрофільних, полярних характеристичних груп з гідрофільною матрицею хроматографічної колонки, рухома фаза є неполярним розчинником, наприклад хлороформ (HC-Cl3). Ця методика використовується для розділення дрібних органічних аналітів, але не дуже підходить для поділу великих білків.
З іншого боку, хроматографія з оберненою фазою (RPC) використовує гідрофобні поверхні білка для взаємодії з гідрофобним лігандом. Гідрофобність білка в основному представлена бічними ланцюгами амінокислот ізолейцин, валін, лейцин, фенілаланін, цистеїн, метіонін та триптофан. Рухлива фаза є високополярним розчинником.
| нормальна фаза | зворотна фаза | |
| характерна група ліганду | гідрофільний | гідрофобний |
| взаємодія з матрицею | гідрофільний | гідрофобний |
| початкова мобільна фаза | неполярний | високополярний |
| елюція | полярний розчинник | неполярний розчинник |
Матриця в RPC - це силікагель або синтетичний сополімер (полістирол), який витримує більш високий робочий тиск. Менші кулі забезпечують кращу роздільну здатність. Вибір ліганду залежить від гідрофобної природи білка, що підлягає очищенню. Матриці з довгим гідрофобним бічним ланцюгом (наприклад, С18) дуже щільно пов'язують білки, тоді як ланцюги С4, відповідно. ароматичні фенільні групи, є більш вільними у зв’язку, тому вони зв’язують лише сильно гідрофобні білки. Загалом, добре починати з матриці з низькою гідрофобністю.
Зменшуючи полярність рухомої фази - шляхом поступового обміну на неполярний органічний розчинник, взаємодія гідрофобних областей білків з матрицею зменшується і відбувається їх елюція. Чим більше гідрофобний білок, тим більший обсяг органічного розчинника використовуватиметься для його елюювання. Найбільш часто використовуваним розчинником є ацетонітрил (H3C-C≡N) або метанол (H3C-OH).
Після вирівнювання колонки наносять розчин білка. На колонці захоплюються лише гідрофобні молекули. Поступово збільшуючи концентрацію органічного розчинника (0-100%), ми досягаємо поступового витіснення білків з матриксу. Найсильніші взаємодії можна зупинити лише через кілька етапів промивання 100% розчинником. Нарешті, знову збалансуйте колонку розчином полярного характеру, або органічний розчинник дуже низької концентрації.
Перевагою зворотно-фазової хроматографії є можливість розділення широкого спектру молекул, включаючи заряджені та полярні молекули, послідовний контроль умов поділу (тип розчинника, концентрація, рН, температура), висока стабільність та ефективність колонки та стійкість. Цей метод підходить для аналітичних цілей, але не дуже підходить для очищення білка для вивчення його біологічних властивостей, оскільки органічний розчинник може спричинити його денатурацію. В основному він використовується в техніці ВЕРХ, яка розділяє білки під вищим тиском рухомої фази. Альтернативою RPC є гідрофобна хроматографія (HIC).