Поширеність мікроспоридіозу кишечника у дітей з важким порушенням харчування в лікарні міста Маракайбо

мікроспоридіозу

Поширеність мікроспоридіозу в кишечнику у дітей з важкою недостатністю харчування в лікарні міста Маракайбо

Acurero-Yamarte Ellen 1 *, Maldonado Ibáñez Adriana 2, Grimaldos Olmos Riam 2, Rivero-Rodríguez Zulbey 2, Bracho Mora Angela 2, Calchi La Corte Marinella 1, Ávila Larreal Ayarí 3, Arráiz Nailet 4

2 Кафедра професійної практики паразитології,

3 Кафедра епідеміології та статистики,

4 Кафедра молекулярної біології Школи біоаналізу Університету Сулії

Для порівняння поширеності мікроспоридіозу в кишечнику у дітей з важким гіпотрофією та евтрофічними дітьми відділення харчового оздоровлення лікарні Chiquinquirá в місті Маракайбо, штат Сулія, метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) був використаний для виявлення Encephalitozoon intestinalis та Enterocytozoon bieneusi у зразках калу 50 дітей з важкою недостатністю та 50 дітей з евтрофією, вік яких був стратифікований наступним чином: молодші немовлята (0-11 місяців), старші немовлята (12-23 місяці), дошкільнята (2-6 років) та школярі ( Від 7 до 12 років). З досліджених видів мікроспоридій Enterocytozoon bieneusi виявлено у 14% дітей з важкою недостатністю та 8% у дітей з евтрофією. У досліджених групах не було виявлено посилень щодо Encephalitozoon intestinalis; Застосовуючи статистичний тест c 2, він не був значущим для змінних мікроспоридіоз кишечника та гіпотрофія. Зроблено висновок, що ступінь, пов’язаний з недоїданням і мікроспоридіозом, важко з’ясувати, оскільки недоїдання є багатофакторним станом, і ще не встановлено, який із цих двох факторів є причиною, а який наслідком.

Ключові слова: Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, CRP, мікроспоридіоз кишечника.

Для порівняння поширеності мікроспоридіозу в кишечнику у дітей з важким порушенням харчування та евтрофічними дітьми у відділенні харчування, лікарні Chiquinquirá у місті Маракайбо, штат Сулія, на полімеразі (ПЛР) була проведена методика ланцюгової реакції для виявлення Encephalitozoon intestinalis та Enterocytozoon bieneusi у зразках калу у 50 здорових та 50 дітей з важкою недостатністю, вік яких був стратифікований наступним чином: молодші немовлята (0-11 місяців), старші немовлята (12-23 місяці), дошкільнята (2-6 років) та діти шкільного віку (7 -12 років). З досліджених видів мікроспоридій Enterocytozoon bieneusi виявився у 14% дітей з важкою недостатністю та 8% у дітей з евтрофією. У досліджених групах посилення щодо Encephalitozoon intestinalis не отримано. Застосовуючи статистичний тест хі-квадрат, результат не був значущим для змінних мікроспоридіозу кишечника та гіпотрофії. Висновки полягають у тому, що ступінь пов’язаності з недоїданням та мікроспоридіозом важко з’ясувати, оскільки недоїдання є багатофакторним станом, і ще не встановлено, який із цих двох факторів є причиною, а який наслідком.

Ключові слова: Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, CRP, мікроспоридіоз кишечника.

Отримано: 11-03-14/Прийнято: 11-23-14

Мікроспоридіоз - це нова та умовно-патогенна інфекція, що виробляється облігатними внутрішньоклітинними спороутворюючими мікроорганізмами, які були таксономічно перекласифіковані як гриби та відомі як мікроспоридії. Інфекції цими мікроорганізмами у людини були практично невідомі до епідемії ВІЛ/СНІДу, коли Enterocytozoon bieneusi було визначено головним збудником діареї у пацієнтів із низьким рівнем вмісту лімфоцитів CD4. Отже, вважається, що імунний статус та наявність інших дефіцитів, мабуть, є визначальними факторами ризику розвитку мікроспоридіальних захворювань, так що, хоча інфекція може також траплятися у імунокомпетентних пацієнтів, мікроспоридіоз частіше вражає людей з ослабленим імунітетом, особливо пацієнтів . зі СНІДом, людей похилого віку, діабетиків, після трансплантації та зі злоякісними пухлинами, дітей або осіб, які використовують контактні лінзи (1, 2).

Оскільки мікроспоридії мають невеликий і компактний геном (3), філогенетичне вивчення групи стало складним. У більшості класичних текстів медицини та гастроентерології їх вивчають як паразитів; однак на сьогодні є достатньо генетичних, структурних та метаболічних доказів, щоб розмістити їх у королівстві грибів. Деякі автори припускають, що вони мають спільного предка зі зигоміцетами і, можливо, з Мукоралесом (4, 5).

В даний час вони знаходяться в типі Microsporidia, який включає 150 родів і включає приблизно 1200 видів, 14 з яких описані як хвороба, що викликає захворювання у людей (2). Види, що впливають на людину, розподілені в 7 родах: ентероцитозоон, енцефалітозон, анкалія (брахіола), нозема, плейстофора, трахіплеїстофора та віттаформа та некласифіковані мікроспорідії (спільно звані мікроспорідій) (2, 6).

Однак на шлунково-кишковий тракт впливають лише Enterocytozoon bieneusi та Encephalitozoon intestinalis, який відомий як мікроспоридіоз кишечника. Ці два види приділяють все більшу увагу, оскільки вони викликають хронічну діарею у хворих на СНІД, поводячись як умовно-патогенні агенти, які, крім того, що викликають кишкову інфекцію, можуть впливати на інші органи та системи (2). Кишкова інфекція, спричинена E. bieneusi, характеризується стійкою, хронічною та виснажливою діареєю у пацієнтів із ослабленим імунітетом та гострою та самообмеженою діареєю у імунокомпетентних осіб, включених до контексту так званої діареї подорожей, E. intestinalis викликає холангіопатію, холангіт, холецистит, безболісно, ​​діарея, перфорація кишечника, однак, це другий за значимістю вид у людини, зараження відбувається при попаданні всередину, вдиханні та прямому посіві спор, передачі через воду через його виявлення в цьому середовищі і хоча кишечник основна мішень інфекції, звідти вона може поширюватися через інфіковані макрофаги в інші органи, такі як: нирки, нижні дихальні шляхи та жовчні шляхи (2, 7).

І E.bieneusi, і E.intestinalis також були пов'язані з недоїданням. Недоїдаючі діти, особливо ті, що належать до категорій важкого недоїдання, страждають від багатьох ускладнень, таких як респіраторні та системні інфекції (які можуть протікати без гарячкової реакції), ураження очей, гастроентерит, діарея та порушення всмоктування (8). Гіпотрофія, як правило, є хворобою, що виникає внаслідок множинних харчових дефіцитів або походить від їх недостатнього використання, що, в свою чергу, спричиняє різні зміни імунної відповіді, включаючи як специфічні, так і неспецифічні механізми, роблячи недоїданого пацієнта сприйнятливим до бактеріальних, паразитарних, що продукуються умовно-патогенними паразитами, такими як кокцидії, а також мікроспорідіями E. bieneusi та E.intestinalis (9).

Незважаючи на важливість цієї теми, мало досліджень з цього приводу: Мікроспоридіоз кишечника та діти, які страждають від недостатності харчування, тому результати цього дослідження сприяли б розповсюдженню знань про ці мікроорганізми у дітей з важкою недостатністю, і це призвело б до кращий клінічний підхід до цих пацієнтів як з терапевтичної, так і з епідеміологічної точки зору, таким чином сприяючи зменшенню захворюваності та смертності від кишкових інфекцій.

У зв’язку з вищезазначеним, було визнано важливим провести це дослідження, щоб визначити поширеність мікроспоридіозу в кишечнику у дітей з важкою недостатністю харчування, що перебувають у відділенні з відновлення харчування лікарні Chiquinquirá в Маракайбо, розташованому в муніципалітеті Маракайбо в штаті Сулія., проводячи порівняння з евтрофними дітьми, які відвідували консультації здорових дітей у тій же лікарні.

Матеріал і метод

Вид розслідування:

Було проведено описове, проспективне, не експериментальне, поперечне переріз дослідження (10).

Населення та вибірка

Досліджене населення складалося з дітей, госпіталізованих у відділення з оздоровлення харчування лікарні Chiquinquirá у місті Маракайбо, серед яких були відібрані сильно недоїдані, а також тих, хто відвідує консультацію здорових дітей тієї ж лікарні, з якої були обрані евтрофні. Вибірка була розрахована за формулою Z2PQN/E2 (N-1) + Z2QP, яка використовується для кінцевих популяцій в якісних дослідженнях, вибираючи особи випадковим чином (11). Таким чином, його склали група з 50 дітей з важким недоїданням (вибірка) та ще одна з 50 евтрофних дітей, які належать до соціально-економічних шарів IV та V згідно із методом Граффара, модифікованим для Венесуели (12), застосованим на основі отриманих даних за допомогою опитування, що додається до клінічної історії кожної людини.

Особи були стратифіковані за статтю у жінок та чоловіків; за станом харчування у сильно недоїдаючих та евтрофних, за віком у маленьких дітей (0-11 місяців), немовлят старшого віку (12-23 місяців), дошкільних закладів (2-6 років) та школярів (7-12 років) (13 ).

Уповноваженому представника кожної дитини було запропоновано провести оцінку стану поживності, також було дано вказівки щодо отримання калу та доставлений одноразовий контейнер для збору для кожної людини. До кожної дитини застосовували наступне:

Оцінка поживності: Оцінка поживності проводилась медичним персоналом підрозділу з оздоровлення харчування та консультацією здорових дітей лікарні Чіквінкіра в місті Маракайбо. Для цього використовували клінічну оцінку та антропометричну оцінку на основі показників ваги-віку, зросту-віку, ваги-зросту, окружності плеча та складки трицепса (14), згідно з даними Фонду дослідницьких центрів зростання. Розвиток населення Венесуели (Fundacredesa), інтерпретація значень за допомогою параметра Z-Score, методу, рекомендованого ВООЗ для оцінки частки хлопчиків та дівчаток, яких можна вважати ризикованими (15).

Паразитологічна оцінка: Після випуску зразків калу їх передавали в лабораторію паразитології Школи біоаналізу Університету Сулії, де обробляли шляхом свіжого дослідження 0,85% фізіологічним сольовим розчином, тимчасовим забарвленням люголю та технікою концентрування Річі. день його збору (16). Частина зразка калу була заморожена для подальшого аналізу ПЛР.

Аналіз молекулярної біології

Було проведено 100 зразків замороженого стільця:

Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР)

1. Вилучення ДНК

Для вилучення геномної ДНК E. bieneusi та E. intestinalis із зразків калу це було проведено за допомогою стандартизованої процедури в лабораторії, яка включала деякі етапи протоколів ферментативного лізису, термічні та механічні удари, описані раніше (17). Приблизно 0,5 - 0,7 г стільця переносили в 2-міліметрову пробірку еппендорфа, ресуспендували в 1 мл сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS: 0,1 М Na 2 HPO 4, 0,1 М NaH 2 PO 4, pH 7,5) і фільтрували через стерильну марлю. Гомогенат центрифугували при 10000 об/хв і отриману гранулу промивали 3 рази буфером 1,5 PBS для видалення розчинних забруднень. Отриману гранулу промивали 1 мл 0,15 М NaCl тричі або до тих пір, поки супернатант не стане прозорим. Гранулу ресуспендували в 600 мкл буфера для лізису (100 мМ Tris-Cl рН 8, 25 мМ ЕДТА, 0,25% SDS) і піддавали 5 циклам заморожування-відтавання, інкубуючи пробірку в сухому льоду-етанолі протягом 5 хв. І розморожували при 37 ° C протягом трьох хвилин.

Після останньої обробки додавали 10 мкл 20 мг/мл протеїнази К. І його інкубували при 55 ° С протягом ночі.

Додавали 60 мкл CTAB-NaCl (0,7 М NaCl, 1% CTAB) та інкубували при 65 ° C протягом 1 години. Екстракцію проводили з 500 мкл хлороформу, потім фенол-хлороформу та хлороформу. Водну фазу відновлювали в іншій пробірці епендорфа, і ДНК осаджували 600 мкл ізопропанолу, інкубуючи його при кімнатній температурі протягом 45 хвилин, а потім центрифугуючи протягом 30 хвилин при 14000 об/хв. Гранулу ресуспендували в 50 мкл буфера ТЕ. 10,5 мкл зразка використовували для аналізів ампліфікації.

2. Ампліфікація ДНК

Області SSU-рРНК (невелика субодиниця рибосомальної РНК) мікроспоридій ампліфікували за допомогою праймерів, специфічних для Encephalitozoon intestinalis, SINTF 5 ? TTTCGAGTGTAAAGGAGTCGA3 ?, положення яких у послідовності від 362 до 382 та SINTR 5 ? CCGTCCTTGCTCC позиції 861 - 881, які підсилюють 520 bp продукту; а для Enterocytozoon bieneusi - EBIEF1 5 ? GAAACTTGTCC ACTCCTTACG3 ?, положення якого в послідовності становить 295-315 і EBIER1 5 ? CCATGCACCACTCCTGCCATT3 ?, положення 881-901, з продуктом посилення 607 п.н.

Так само, відповідно до досліджених видів мікроспоридій (10 мл загартованої ДНК E. intestinalis або E. bieneusi), були встановлені відповідні негативні контролі (10 мл дистильованої води) та позитивні контролі. Для ампліфікації використовували ДНК-полімеразу GoTaq Flexi (Promega). Праймери та необхідні умови ПЛР були змінені таким чином, що ампліфікація відбувалась у кожному випадку.

Реакції проводили в термоциклері (термоциклер PTC-100 Пельтьє), поміщали повністю ідентифіковані пробірки. Цикли ПЛР проводили відповідно до протоколу, визначеного для кожної пари праймерів, для яких потрібно було провести попередню стандартизацію. Для олігонуклеотидів SINT5/3, специфічних для E.nintestinalis, стадію денатурації 5 хвилин при 94 ° C і 35 циклів ампліфікації проводили двічі безперервно, потім 30 секунд при 45 ° C (вирівнювання олігонуклеотидів) і 30 секунд при 72 ° C (полімеризація). Щоб закінчити посилення, 5 хвилин при 72 ° C.

З іншого боку, для олігонуклеотидів EBIE5/3 від E. bieneusi також проводили 35 циклів по 5 хвилин при 94 ° C денатурації, потім 30 секунд при 94 ° C того ж процесу, після чого 30 секунд при 55 ° C (вирівнювання олігонуклеотидів) і закінчити 90 секунд при 72 ° C, останній етап називається полімеризацією.

3. Електрофорез продуктів ДНК

Продукти ПЛР розділяли на агарозних гелях з горизонтальними камерами (BIORAD). Використана концентрація агарози становила 2%. TBE (89 мМ трис-борат, 2 мМ EDTA рН 8) використовували як пропускний буфер. Пробіг проводили при 90 об./См протягом 40 хвилин. Гелі фарбували у вигляді бромистого етидію, візуалізували в ультрафіолетовому просвічувачі та фотографували за допомогою системи фотодокументації DigiDoc UVP. Був включений маркер молекулярної маси PROMEGA DNA Ladder 1000 bp.

Аналіз даних проводився за допомогою описової статистики з використанням абсолютних значень та відсотків, для чого були підготовлені таблиці отриманих результатів, що представляють основні змінні, що досліджуються. Квадрат Пірсона Хі (c 2) використовували з рівнем довіри 95% (с

За допомогою методики полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ДНК мікроспоридії була виявлена ​​у 11 осіб, 7 зразків ампліфіковано на E. bieneusi з групи сильно недоїдаючих дітей, що представляє поширеність цього мікроорганізму 14%, тоді як для групи мікроорганізмів у евтрофних дітей ампліфікували лише 4 зразки, отримуючи поширеність 8%, при застосуванні статистичного тесту c 2 це не було значущим для змінних гіпотрофія та мікроспоридія кишечника (c 2 = 0,9 п. E. intestinalis у досліджуваних групах. Отримані результати відповідно до використовуваної методики можна побачити в таблиці 1. На малюнках 1 і 2 показані деякі результати горизонтального електрофорезу в агарозних гелях.

Таблиця 1. Поширеність мікроспоридії кишечника, виявленої методом ПЛР, у дітей з серйозною недостатністю, що оздоровлюються, та у дітей з евтрофією, які проводять консультації здорових дітей лікарні Чіхінквіра в місті Маракайбо, штат Сулія. Венесуела, 2013.