Резюме

Шизофренія - поширене та етіологічно неоднорідне захворювання. Хоча успадкування шизофренічних синдромів є складним, оскільки генетичні та екологічні фактори сприяють клінічному фенотипу, періодична кататонія, сімейний підтип кататонічної шизофренії, передається аутосомно-домінантним чином. Тут ми повідомляємо, що мутація Leu309Met у WKL1, позиційному гені-кандидаті в хромосомі 22q13.33, який кодує передбачуваний неселективний катіонний канал, експресований виключно в мозку, ко-секретується з періодичною кататонією в розширеному родоводі. Структурний аналіз показав, що ця нісенітна мутація викликає конформаційні зміни мутантного білка. Наші результати не тільки підкреслюють важливість генетичних механізмів в етіології шизофренічних синдромів, але також дають краще розуміння патогенезу та інвалідизуючого перебігу кататонічної шизофренії та пов'язаних з нею розладів.

Доступ надано

Довіритель

Періодична кататонія, сімейний підтип кататонічної шизофренії (MIM 605419) - це генетично неоднорідний розлад, що характеризується психозом та психомоторними розладами. Пацієнти з періодичною кататонією виражають змінний фенотип, що поєднує акінетичний негативізм, гіперкінези зі стереотипами та паракінетичними рухами, а також підвищену тривожність, імпульсивність та агресивність.1 Гострі психотичні епізоди можуть супроводжуватися галюцинаціями та маренням, тоді як епізоди послідовної кататонії призводять до більшої кількості і важче. залишковий статус На підставі клінічних доказів генетичного передбачення та сукупного ризику захворюваності приблизно 27% у родичів пацієнтів першого ступеня прогнозували значний генетичний ефект для деяких форм періодичної кататонії23.

Нещодавно наша група повідомила про сканування зв’язку всього геному 12 німецьких родоводів з періодичним підтипом кататонічної шизофренії, що включає 137 осіб, у тому числі 57 постраждалих.4 У цій вибірці отримано значні докази зв’язку на хромосомі 15q15 за допомогою непараметричних багатоточкових методів аналізу (GENEHUNTER -PLUS LOD * оцінка 3,57, P = 0,000026). Для другого локусу, в основному підтримуваного однією великою родиною (рис. 1), знайдено суперечливі докази зв’язку для маркера D22S1169 на хромосомі 22q13,33 (оцінка LOD * 1,85, P = 0,0018). Генотипування специфічних поліморфних маркерів для 22-ї хромосоми звузило область, що представляє інтерес для інтервалу теломер D22S1160, що складає c 4 см (J Meyer et al, неопубліковані дані). KIAA0027, часткова кДНК, депонована в GenBank5 з коротким і потенційно нестабільним відрізком CTG, була серед кількох позиційних кандидатів, розташованих у цій області, які були обрані для подальшого дослідження. Геномна анотація KIAA0027 (на основі номерів приєднання GenBank D25217 для кДНК та AL022327 для геномного PAC-клону RP3–355C18) виявила 12 екзонів, що охоплюють ∼ 28 Мб.

мутація

Сегрегація алелю C1121A у німецькому родоводі із сімейною кататонічною шизофренією. Уражені кінцівки символізують чорні діаманти. Мутаційна мутація кодує метіонін (М) замість амінокислотного залишку лейцину (L). Надано алелі двох сусідніх поліморфних маркерів (D22S1149 та D22S526). Індивідуальна ДНК 8u10 була недоступна для аналізу мутацій, і тому алелі були виведені з даних сканування зв'язків. Гаплотипи, передбачені від померлих осіб, наведені в дужках.

Повнорозмірне зображення

Прогнозована амінокислотна послідовність WKL1 (номер приєднання GenBank AF319633) та вирівнювання з KCNA1 (L02750). Підкреслено шість потенційних трансмембранних доменів (S1-S6) та передбачувану область пор (P). Вказується місце мутації Leu309Met в S6.

Повнорозмірне зображення

Електроферограма, що показує послідовність частини екзону 11, виявила трансверсію C → A в нуклеотидному положенні 1121 у пацієнта 8u12.

Повнорозмірне зображення

Ми розширили 5′-UTR KIAA0027 в 5′-RACE до загальної довжини кДНК 3515 пар основ (номер приєднання GenBank AF319633). У розширеному 5′-UTR стоп-кодон (TGA) був знайдений у раніше повідомленій відкритій рамці зчитування.5 Отже, кодон ATG в нуклеотидному положенні 197 слід вважати правильним початком трансляції, в результаті чого білок становить 377 аміно залишки кислоти (рисунок 4). Цей новий білок був тимчасово позначений як WKL1.

Північний аналіз експресії WKL1 у різних регіонах мозку та периферичних тканинах.

Повнорозмірне зображення

Північний аналіз мРНК WKL1 виявив одну смугу розміром не більше 3,6 кб, і транскрипти були виявлені виключно в мозку людини з найбільшою інтенсивністю сигналу, виявленою в мигдалині, ядрі каудату, таламусі та гіпокампі (рис.4). Розмір транскрипту WKL1 узгоджується з результатами, отриманими за допомогою методики 5'-RACE, хоча не можна виключати існування варіантів сплайсингу в різних областях мозку або під час нейророзвитку. Більш детальна оцінка експресії WKL1 з використанням як північної, так і in situ гібридизації людського мозку посмертно продемонструвала розшифровки також у корі енторіалу, путамені, чорній субстанції та мозочку (A Schmitt et al, рукопис у підготовці). Виявленої експресії в периферичних тканинах, включаючи серце та скелетні м'язи, не виявлено (рис. 4).

Аналіз переглянутої структури білка WKL1 виявив шість передбачуваних трансмембранних доменів (S1-S6) з областю пор (P) між S5 і S6 (рис.2) .6 Хоча найвищі показники ідентичності були отримані для залежних від напруги калійних шейкерів людини канал KCNA1, 78, за яким слідують інші члени цього розширеного сімейства генів, характерні особливості, такі як датчик напруги в S4 та фільтр селективності в області Р, погано зберігаються.910 Ці характеристики свідчать про те, що білок WKL1 може діяти як неселективний нейронального катіонного каналу і, отже, може представляти першого члена нової підродини, віддалено пов'язаної з надсімейством калієвих каналів, пов'язаних із шейкером

У сукупності наші результати дають докази того, що гаплонедостатність WKL1 спричинює періодичний підтип кататонічної шизофренії. Мутація Leu309Met є першою в патогенно релевантному гені, асоційованою з шизофренічним розладом, виявленим за допомогою аналізу зв’язку з подальшим позиційним клонуванням. Ідентифікація гена, пов'язаного з шизофренією, забезпечить потужний інструмент для розуміння етіопатогенезу кататонічної шизофренії та пов'язаних з нею розладів. Розробка причинного лікування цих руйнівних та дорогих розладів тепер може бути реалістичною перспективою та досяжною метою.

Методи

Клінічна

Сім'я мультиплексів була визначена, як описано вище.4. Дослідження було схвалено Комітетом з етики Університету Вюрцбурга, і всі особи взяли участь після надання інформованої згоди.

Мутаційний аналіз

Екзони гена WKL1 від пацієнтів та контролів посилювались у термоциклері T-GRADIENT (Biometra, Göttingen, Німеччина). ПЛР проводили на кінцевому об'ємі 25 мкл, що містив 60 нг геномної ДНК, 10 пмоль кожного праймера, 200 мкМ кожного dNTP, 1,0 або 1,5 мМ MgCl 2, 50 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl (pH 8,3 при 25 ° С). В). C), 0,025 мг мл-1 BSA, 0,025% Твін 20 та 0,5 U Taq ДНК-полімерази (Eurogentec, Seraing, Бельгія). Отримані ПЛР-продукти секвенували за допомогою автоматизованого секвенсора ABI 310 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Для підтвердження та відбору C1121A екзон 11 ампліфікували з ДНК від 327 непов'язаних добровольців (654 хромосоми) та всіх членів сім'ї, крім особини 8u10, ДНК якої була недоступна для цього дослідження. Праймерами для екзону 11 були 5'-TGGCTCGGTCACTTTTATTCC-3 'та 5'-CCCACAGGCTTCTCACCTC-3', відповідно. Продукти ПЛР сімейства аналізували шляхом розщеплення Sfa NI, а потім отримані фрагменти відокремлювали на агарозних гелях, забарвлених 2% бромідом етидію.

5′-гонка

Для 5'-RACE загальну РНК виділяли з гіпокампу дорослої людини за допомогою розчину peqGOLD RNAPure (Peqlab, Ерланген, Німеччина). Синтез кДНК та 5'-RACE проводили за допомогою набору Smart RACE (Clontech, Пало-Альто, Каліфорнія, США) згідно з інструкціями виробника. Початкове амплификацию проводили з праймерами, специфічними 5'-CTGCTCTGC генів RACE1 CGTTGGGAGCACTGG-3 «і 5'-GCCGTTGGG AGCACTGGTCTCTGGTCTGGGTGGTCTGG RACE2-3», з подальшою ПЛР з використанням специфічних генетичних semicentrada RACE3 праймера 5'-GGGTCTCGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTTGGGGTGGTGGGGTGGGGTGGGGTGG-3 «кДНК завершеною WKL1 а Виведені послідовності амінокислот аналізували та порівнювали з іншими відповідними генами за допомогою алгоритму BLAST та програмного пакету MacVector. Передбачувані трансмембранні домени прогнозували за допомогою процедур онлайн-аналізу білка, включаючи SMART (//smart.embl-heidelberg.de), EXPASY (// expasy. Proteome.org.au/tools/#align) та PSORT II (// psort. nibb.ac.jp).

Північна пляма

Людські мембрани Норт-блот з однаковими кількостями полі А + мРНК (Clontech) з різних областей мозку та периферичних тканин були гібридизовані до 32-міченої вставки IMAGE клону 3222221 (Ресурсний центр, Берлін), що відповідає ∼ 700 в.п. 3 ' -кінця гена WKL1 за протоколом, наданим виробником. Гібридизовані мембрани піддавали фотоплівці (Kodak XR).

Висловлення подяки

Автори хочуть висловити подяку учасникам дослідження та їхнім родинам. Вони також дякують П. Рідереру за обмін зразками людського мозку, М. Шартлу та С. Шереру за допомогу в аналізі білків, а К. Мюллер-Рейблі за корисні дискусії.