реферат

У еукаріотів багато генів піддаються альтернативному зрощуванню і кодують безліч ізоформ, що призводить до експресії споріднених білків з різними біохімічними та біологічними властивостями (Andreadis et al., 1987). IG20 (інсулінома - глюкагонома) - це один із таких генів, який може кодувати щонайменше чотири різні варіанти сплайсингу (SV), а саме IG20pa (тобто IG20 проапоптотичний), MADD/DENN, IG20-SV2 та DENN-SV (Goto et al., 1992, Чоу та Лі, 1996, 1998; Каннінгем, 1996; Шивелла та ін., 1997; Аль-Зубі та ін., 2001). Ці чотири IG20 -SV відрізняються диференціальним сплайсингом екзонів 13L і 16. Щодо IG20pa, MADD, IG20-SV2 та DENN-SV не експресують екзон 16 або 13L або обидва (Al-Zoubi et al., 2001).

Ген IG20 відіграє важливу роль у проліферації, апоптозі та виживанні ракових клітин (Chow and Lee, 1996, 1998; Schievella et al., 1997; Brinkman et al., 1999; Murakami-Mori et al., 1999; Telliez et al., 2000, Al-Zoubi et al., 2001; Lim and Chow, 2002; Efimova et al., 2003, 2004; Lim et al., 2004; Ramaswamy et al., 2004). Крім того, він відіграє важливу роль у нейротрансмісії (Zhang et al., 1998; Tanaka et al., 2001; Yamaguchi et al., 2002), нейродегенерації (Del Villar and Miller, 2004) та обміні гуанінових нуклеотидів (Wada et al. . 1997, Brown and Howe, 1998; Iwasaki and Toyonaga, 2000; Levivier et al., 2001). Ці розбіжні функції, швидше за все, опосередковані альтернативним сплайсингом (Chow et al., 1998; Al-Zoubi et al., 2001; Efimova et al., 2004).

Рівень експресії гена IG20 вищий у ракових клітинах і тканинах порівняно з їх нормальними аналогами. Хоча MADD та DENN-SV є конститутивно вираженими (DENN-SV надмірно експресується порівняно з іншими SV у раку), експресія IG20pa та IG20-SV2 регулюється тим, що вони можуть експресуватись або не експресуватись у певних клітинах. Це вказує на те, що IG20pa та IG20-SV2 не потрібні для виживання клітин (Efimova et al., 2004).

Раніше ми проводили дослідження для посилення функції за допомогою експресії окремих IG20-SV у клітинах HeLa і показали, що варіанти MADD та IG20-SV2 мало чи зовсім не впливають на проліферацію клітин та індукований апоптоз. Хоча IG20pa підвищує чутливість як до зовнішніх, так і до внутрішніх апоптотичних подразників і пригнічує проліферацію клітин, DENN-SV забезпечив стійкість до індукованого апоптозу та посилення проліферації клітин. Таким чином, IG20pa та DENN-SV діяли як "супресор пухлини" та "онкоген" (Efimova et al., 2004).

Нокдаун усіх ендогенних IG20-SV з використанням антисмислових олігонуклеотидів привів до спонтанного апоптозу ракових клітин in vitro та in vivo (Lim and Chow, 2002; Lim et al., 2004). Таким чином, контрастні ефекти IG20-SV, згадані вище, можна з'ясувати лише шляхом виключення окремих IG20-SV та визначення подальших ефектів. Це спричинило кілька викликів, оскільки IG20-SV відрізнявся лише диференціальною експресією екзонів 13L (130 bp) та 16 (60 bp) (Al-Zoubi et al., 2001). Однак, використовуючи невеликі РНК-шпильки (shRNAs), які спеціально націлені на екзони 13L, 15 і 16, ми змогли вибірково осадити або всі, або різні комбінації IG20-SV у клітинних лініях HeLa та PA-1 і визначити їх роль у виживанні клітини. Наші результати показують, що MADD сам по собі необхідний і достатній для виживання цих ракових клітин.

результат

Невеликі інгібуючі РНК можуть вибірково зменшити експресію екзогенного IG20-SV

Для визначення IG20-SV, які сприяють апоптозу та проліферації клітин, ми використовували малі інгібуючі РНК (siРНК) для вибіркового зменшення IG20-SV (таблиця 1) (McManus and Sharp, 2002; Cullen, 2004; Hall, 2004). SiRNA клонували у вектор pSUPER (Brummelkamp et al., 2002), щоб забезпечити експресію shRNA. Клітини 293T трансфікували або YFP-IG20pa, YFP-MADD, або YFP-DENN-SV, разом з різними векторами pSUPER, що експресують рРНК при 1: 1, 1: 3 та 1: 7. Зменшення експресії YFP показало збій відповідного білка вираз. Проведено скринінг кількох РНК, і результати найбільш ефективних показані на малюнку 1а. 13L-shRNA, націлена на екзон 13L, знижений за допомогою IG20pa/MADD, залишаючи експресію DENN-SV незмінною. На відміну від цього, 16E-shRNA націлена на екзон 16, знижений за допомогою IG20pa, але не MADD/DENN-SV. Середній рівень РНК, націлений на екзон 15, знизив модуляцію всіх тестованих IG20-SV. Поодинокий вектор або контрольна shRNA мало чи майже не впливали на експресію IG20-SV.

Стіл в натуральну величину

варіант

Скринінг шРНК на нокдаун IG20. a ) Зниження експресії екзогенних IG20-SV. Клітини 293T висівали в 12-лункові планшети та ко-трансфікували зазначеними конструкціями IG20-SV-YFP та pSUPER-shRNA. Експресія YFP виражається як середня інтенсивність флуоресценції. Представлені дані (середнє значення ± SD три повторності) є репрезентативними для трьох незалежних експериментів, кожен зі значеннями P

Понижена модуляція ендогенного IG20-SV у клітинах HeLa. Один мікрограм загальної РНК, отриманої з клітин HeLa через 72 години після трансдукції, використовували для ланцюгової реакції зворотної транскрипції-полімерази. Продукти розділяли на 2% агарозному гелі. ( a ) Посилення всіх чотирьох IG20-SV за допомогою праймерів F2-B2. ( b ) Кількісне визначення відносної інтенсивності смуги з панелі та використання Alpha Imager (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). ( c ) Підсилення IG20pa та MADD за допомогою праймерів 13L-вперед та B2-реверс. d ) Кількісне визначення відносної інтенсивності смуги з панелі c.

Повнорозмірне зображення

Понижена модуляція IG20-SV у клітинах HeLa призводить до спонтанного апоптозу

Спонтанну загибель клітин визначали за допомогою ядерної конденсації (Hoechst 33342) (рис. 3а та b) та втрати потенціалу мітохондріальної мембрани (фарбування ефіру тетраметилродаміну [TMRM]) (рис. 3в та г). Понижена модуляція всіх IG20-SV з Mid-shRNA призвела до значного спонтанного апоптозу. Хоча знижена модуляція IG20pa/IG20-SV2 не мала ефекту, скасування MADD/IG20pa призвело до збільшення спонтанного апоптозу. Щоб визначити, чи основна причина спонтанного апоптозу була подібною до тієї, яка спостерігалася під час апоптозу, викликаного або зовнішнім (каспаза-8), або внутрішнім шляхом (каспаза-9), ми визначили відсоток клітин, що експресують активні каспази-8 та -9. методом проточної цитометрії.

Вплив знижувальної модуляції IG20-SV на клітини HeLa. ( a ) Фарбування Hoechst - через 72 год після трансдукції клітини HeLa збирали і фарбували 5 мкг/мл Hoechst і піддавали аналізу сортування клітин, активованому флуоресценцією (FACS). Відсоток високопозитивних клітин (апоптотичних клітин) показано на гістограмах. ( b ) Підсумок результатів, що показує відсоток клітин із підвищеною ядерною конденсацією, виміряний за допомогою фарбування Хохста в трьох незалежних експериментах. Значення Р становило

Активація каспази після зниженої модуляції IG20-SV. ( a ) Загальна активація каспази - клітини HeLa збирали через 60 годин після трансдукції та фарбували для всіх активованих каспаз за допомогою Red-z-VAD-FMK; ( b ) для каспази-8 з червоним IETD-FMK; a ( c ) для каспази-9 з Red-LEHD-FMK та проаналізовано FACS. Показано відсоток активації каспази в GFP-позитивних клітинах (середнє значення ± SD тричі).

Повнорозмірне зображення

Понижена модуляція IG20-SV не має очевидного впливу на проліферацію клітин HeLa

Для оцінки впливу на ріст та проліферацію клітин підраховували різні життєздатні клітини, що експресують РНК. Порівняно з контролем, спостерігалося значне зменшення кількості життєздатних клітин, що експресують Mid- та 13L-shRNA (рис. 5а). Недостатня різниця в розведенні CFSE (карбонова кислота SNARF-1, ацетат, сукцинімідиловий ефір) з часом між контрольними клітинами, обробленими клітинами Mid- і 13L-shRNA, свідчить про те, що різниця в кількості клітин не була зумовлена ​​зменшенням проліферації (рис. шляхом висівання однакової кількості клітин HeLa, що експресують різні shRNA, і визначення кількості та розміру колоній через 12 днів. Хоча значно менше колоній було утворено клітинами, що експресують Mid та 13L-shRNA (панелі d, e), розмір колоній був порівнянний з розміром контрольних груп. Крім того, оброблені shRNA клітини не продемонстрували суттєвих відмінностей у прогресуванні клітинного циклу (не показано). У сукупності ці результати показали, що абляція MADD в першу чергу призводить до спонтанного апоптозу.

Вплив понижуючої модуляції IG20 на проліферацію клітин Hela. a ) Ріст клітин. Через двадцять чотири години після трансдукції клітини HeLa висівали, як описано в матеріалах та методах. Потім клітини збирали і підраховували життєздатні клітини (негативні трипанові сині клітини) у зазначені дні. Дані є середніми ± SD три повторності. ( b ) Розмноження клітин. Через двадцять чотири години після трансдукції клітини HeLa фарбували CFSE-червоним (SNARF-1-карбонова кислота, ацетат, сукцинімідиловий ефір), збирали в зазначені дні і оцінювали на розведення CFSE шляхом сортування клітин, активованого флуоресценцією. Цифри на гістограмах показують геометричний пік середньої інтенсивності фарбування CFSE у трансдукованих клітинах. ( c - g ) Виживання клітин. Показує фарбування клітин, що вижили через 12 днів після зниження модуляції IG20 -SV, у кришталево-фіолетовий колір.

Повнорозмірне зображення

Зниження MADD в клітинах карциноми яєчників PA-1 призводить до спонтанного апоптозу

У клітинах HeLa ми могли або зменшити модуляцію всіх чотирьох, або комбінацію IG20pa/MADD або IG20pa/IG20-SV2. Щоб далі продемонструвати, що MADD необхідний для виживання клітин, ми використовували клітини раку яєчників PA-1, які по суті експресують лише MADD та DENN-SV (Efimova et al., 2004), дозволяючи таким чином ексклюзивну знижену модуляцію MADD 13L-shRNA. Хоча модульована MADD/DENN-SV середньошРНК модульована вниз, 13L-шРНК лише скасувала експресію MADD (рис. 6а та b). Спонтанний апоптоз виявився приблизно у 50% клітин через 72 години після трансдукції 13L-shRNA (рис. 6c та d).

Вплив понижуючої модуляції IG20 у клітинах PA-1. ( a ) Модернізація ендогенного IG20 у клітинах PA-1. Зворотна транскрипція-полімеразна ланцюгова реакція IG20-SV з клітин PA-1, через 72 год після трансдукції, з використанням праймерів F2-B2. ( b ) Посилення IG20pa та MADD лише за допомогою праймерів 13L-F та B2. c ) Ядерна конденсація. Через сімдесят дві години після трансдукції клітини PA-1 фарбували барвником Hoechst та аналізували за допомогою сортування клітин, активованого флуоресценцією (FACS). Відсотки апоптотичних клітин показані на гістограмах. ( d ) Деполяризація мітохондрій. Через сімдесят дві години після трансдукції клітини PA-1 фарбували TMRM та аналізували FACS. Представлені дані є репрезентативними для трьох різних експериментів.

Повнорозмірне зображення

Ми визначили здатність аналогічно оброблених клітин PA-1 проліферувати. Культивували рівну кількість клітин PA-1, які отримували різні методи лікування (через 24 години після трансдукції), і кількість життєздатних клітин визначали в різні моменти часу (рис. 7а). Хоча втрата MADD призвела до значного зменшення кількості клітин, подібно до клітин HeLa, вона не впливала на розведення CFSE або розмір колонії (рис. 7b-g).

Вплив понижуючої модуляції IG20 на проліферацію клітин PA-1:( a ) ріст клітин, ( b ) розповсюдження, ( c ) виживання клітин. Експерименти проводили, як описано вище, з клітинами HeLa (див. Легенду рисунку 5). Представлені дані є репрезентативними для трьох різних експериментів.

Повнорозмірне зображення

MADD, а не DENN-SV, може запобігти спонтанному апоптозу

Нокдаун лише MADD у клітинах PA-1 призвів до спонтанного апоптозу. Щоб визначити, чи може експресія DENN-SV врятувати клітини від підвищеного спонтанного апоптозу, вони ко-експресували 13L та 16E shRNA в клітинах HeLa і виявили збільшення спонтанного апоптозу. Це ще більше підтвердило критичну вимогу MADD, а не DENN-SV, до виживання клітин (рис. 8).

Понижена модуляція MADD викликає спонтанний апоптоз. Клітини HeLa заражали вищевказаними лентівірусами, що експресують шент. Сімдесят дві години після трансдукції ( a ), проводили ланцюгову реакцію зворотної транскрипції-полімерази, як описано вище, і продукти розділяли на 2% агарозному гелі. ( b ) Для визначення спонтанного апоптозу проводили фарбування за Гохстом.

Повнорозмірне зображення

Щоб наочно продемонструвати фундаментальну роль MADD у виживанні клітин, ми створили клітини HeLa, які стабільно експресують MADD-YFP-Mut та DENN-SV-YFP-Mut (рис. 1b). Як показано на малюнку 9а, через 72 год після трансдукції Mid-shRNA не змогла знизити модуляцію ні MADD-YFP-Mut, ні DENN-SV-YFP-Mut; тоді як 13L-shRNA може знижувати модуляцію як ендогенних, так і MADD-YFP-Mut. Цікаво, що експресія MADD-YFP-Mut, а не DENN-SV-YFP-Mut, була достатньою для запобігання виникненню спонтанного апоптозу в клітинах Hela, оброблених Mid-shRNA (Малюнок 9b). Подібні результати були отримані в клітинах PA-1 (не показано). Ці результати чітко показують, що MADD сам по собі може перешкодити раковим клітинам зазнати спонтанного апоптозу.

MADD, а не DENN-SV, може запобігти спонтанному апоптозу. ( a ) IG20-SV ланцюгова реакція зворотної транскрипції-полімерази з клітин, постійно трансфікованих або контрольним вектором, MADD-YFP-Mut, або DENN-SV-YFP-Mut, і інфікованих зазначеними вірусами, що експресують shRNA, протягом 72 годин. b ) Ядерна конденсація. Клітини HeLa фарбували Hoechst для визначення спонтанного апоптозу. Представлені дані є репрезентативними для трьох різних експериментів (P