тамоксифен

  • предметів
  • реферат
  • Головний
  • результат
  • Там це спричинило зменшення жирової маси у мишей
  • Там він сприяв апоптозу та аутофагії в жировій тканині
  • Там він підтримав виробництво ROS
  • Антиоксидант ліквідував індуковану там АФК, апоптоз та аутофагію
  • Антиоксидант змінив індуковане Там зниження щільності клітин та популяції адипоцитів
  • Антиоксидант зворотно знижує регуляцію гамма-рецептора, що активується проліфератором пероксисоми, PPARγ
  • обговорення
  • Матеріали і методи
  • матеріалів
  • мишей
  • Культура клітин та лікування
  • Вимірювання АФК
  • Вестерн-блот
  • Статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткове зображення S1
  • Додаткове зображення S2
  • Документи Word
  • Додаткові легенди зображення
  • глосарій

предметів

  • біохімія
  • Медикаментозна терапія
  • Ожиріння

реферат

Щоб зрозуміти молекулярний механізм розвитку ожиріння, були розроблені різні моделі гризунів, які вивчають посилення або втрату функції різних генів. 6, 7 З цією метою специфічна для сайту рекомбінантна система Cre/lox була універсальною для генерування умовних мутантів мишей, контролю експресії генів та активності в тканинах-мішенях. 8, 9 Тамоксифен (Tam) в основному використовується для активації Cre рекомбіназ просторово in vivo шляхом внутрішньочеревного (ІП) або підшкірного введення. 10, 11, 12 Ін’єкція Там у дозі 1 - 8 мг/кг маси тіла протягом 5 днів поспіль видаляє цільові гени, створюючи комплексну систему для вивчення функціональних генів при ожирінні. 8, 9, 10, 11, 12

результат

Там це спричинило зменшення жирової маси у мишей

Щоб перевірити вплив Tam на жирову масу, ми провели 5-денне введення Tam (1 мг/20 г маси тіла) на флокованих мишей-вилок O1 (Fox01) без мишей Cre recombinase (f-Fox01), 15, 16, 17 згідно стандартного протоколу, встановленого раніше. 12 Через два тижні після введення Там жир у мишей f-Fox01 зменшився на 34% (Р 15, 16, і ми виявили, що маса жиру також значно зменшилася (26%, Р

Відмічалося зменшення жирової маси у мишей f-Fox01. a ) Кінетика регулювання маси жиру через 5 днів прийому Там. ( b ) Вимірювання маси тіла до лікування Там (до-там), 2 тижні (2 тижні) та 6 тижнів (6 тижнів) після ін’єкції Там. ( c ) Епідидимальна маса жирової тканини (eWAT) на 2-му тижні у мишей, оброблених Там. ( d ) вага eWAT на 6 тижні у мишей, які отримували лікування там. n = 4-6; * P 18, 19, 20, 21, 22, 23 Щоб дослідити, чи впливає Там на апоптоз та аутофагію, ми використовували eWAT на 2 і 6 тижнях після введення Там і аналізували медіатори апоптозу та аутофагів - активовану або розщеплену каспазу 3 (Cas3 ). (c)) та кон'югат 3-фосфатидилетаноламіну білка легкого ланцюга 1A/1B (LC3). 24, 25 Як показано на малюнках 2a та b, лікування Там збільшувало рівні Cas3 (c) у 6-8 разів (P

Там він сприяв АФК та ​​окисному стресу. ( a ) Вестерн-блоттінг HO1 в жировій тканині миші на 2 і 6 тижнях після введення Там з GAPDH (гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназа), зондований як контроль навантаження. ( b ) денситометричний аналіз західних передавальних зображень за допомогою програмного забезпечення NIH ImageJ; n = 6–8. c ) Вимірювання АФК в жировій тканині через 2 тижні після введення Там (n = 3-4). d ) Вимірювання АФК у жировій тканині на 6 тижні після введення Там (n = 3-4). ** P 32, 33 Як спостерігали в жировій тканині, Tam індукував значну підвищену регуляцію HO1 в адипоцитах 3T3L1, і ефект залежав від дози в діапазоні тестування 0 - 128 мкМ (додаткова фігура S2). Там також сприяли виробництву АФК в 2,5 рази (P

Антиоксидант NAC послабив рівень АФК і змінив ефекти там. a ) Вимірювання АФК в адипоцитах 3T3L1. ( b a c ) Вестерн-блот-аналіз ( b ) HO, Cas3 (c) і LC3 в адипоцитах 3T3L1 після 48 годин обробки Tam (128 мкМ) або Tam (128 мкМ) плюс NAC (1 мМ), з денситометричним аналізом ( c ) Західні передавальні зображення за допомогою програмного забезпечення NIH ImageJ; GAPDH (гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназа) тестували як контроль навантаження. n = 3-5; * P 2 ми запитали, чи впливає лікування Там на щільність клітин. Порівняно з адипоцитами, обробленими носієм, клітини, оброблені Там, продемонстрували значне зниження щільності клітин (24%, Р 34, 35, 36. Тим не менше, додавання RAC-поглинача NAC значно відновило щільність клітин і зрілу популяцію адипоцитів (рис. д).

Антиоксидант NAC послаблює вплив на щільність клітин та зрілу популяцію адипоцитів. a - c ) мікроскопічне зображення адипоцитів 3T3L1, оброблених носієм ( a ), 128 мкМ там ( b ) і Tam (128 мкМ) плюс NAC (1 мМ) ( c ). Мікроскоп був встановлений на x 100. ( d a e ) Вимірювання щільності клітин та популяції зрілих адипоцитів за допомогою програмного забезпечення NIH ImageJ; n = 6–8. * P 34, 35, 37 Спостереження за зменшеною популяцією зрілих адипоцитів після лікування Там привело нас до аналізу впливу Tam на PPARγ. Як показано на малюнку 6а, рівень γ-білка PPAR знизився на 74% в адипоцитах, оброблених Там (P

Механізм, за допомогою якого Там зменшує жирову масу, включає кілька клітинних подій. Лікування Посилюється апоптоз і аутофагія, процеси, що зменшують кількість адипоцитів і беруть участь у регуляції жиру. 2, 18, 19, 20, 21, 22, 23 Після лікування там щільність клітин та популяція зрілих адипоцитів фактично зменшились. Там він також сприяв дедиференціації адипоцитів та виробленню АФК, тоді як нормалізація рівнів АФК суттєво послаблювала дедіференціацію адипоцитів, викликану Там, апоптоз та аутофагію, відновлюючи при цьому стару популяцію адипоцитів та жирову масу. Разом із нашими даними ми настійно наводимо на думку, що короткочасне (5-денне) лікування Там зменшує жирову масу за рахунок збільшення виробництва АФК.

Там було показано, що індукує АФК та ​​окислювальний стрес у клітинах раку молочної залози, клітинах гепатобластоми, клітинах сітківки та тромбоцитах завдяки активації NAD (P) H оксидази, ферменту, який також сприяє виробленню АФК у макрофагах. 32, 42, 43, 44, 45, 46 Ефект посилення АФК там був розширений і додатково підтверджений нашим дослідженням в адипоцитах та жировій тканині. Важливо, що ми виявили, що збільшення АФК призвело до зниження регуляції PPARγ та дедиференціації адипоцитів, підтримуючи думку про те, що зрілі адипоцити піддаються дедиференціації в стресових умовах. 34, 35 Було показано, що прозапальні адипоцитокіни (наприклад, TNFα) можуть сприяти дедиференціації адипоцитів шляхом зниження регуляції PPARγ. 34, 35 Оскільки підвищення рівня АФК або окислювальний стрес збільшує вироблення TNFα, 47 Там це може сприяти дедиференціації адипоцитів шляхом активації осі γ ROS-TNF α - PPAR. З цією метою інфільтрація макрофагів у жирову тканину може зіграти певну роль, оскільки було показано, що ці фагоцити індукують продукцію АФК і TNFα, а також чутливо реагують на опосередковані АФК та ​​TNFα сигнальні каскади. 46, 48

Матеріали і методи

матеріалів

Засіб Dulbecco's Eagle (DMEM) було від Corning Inc. (Манассас, штат Вірджинія, США). Фетальна бичача сироватка (FBS) була від GeneMate (Kaysville, UT, США). Дексаметазон, 3-ізобутил-1-метилксантин (IBMX), розиглітазон та Там були придбані у Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Пеніцилін/стрептоміцин (P/S) отримували лабораторії HyClone GE Healthcare Life Sciences (Логан, штат Юта, США). Інсулін та НАК отримували Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Фосфатний буфер (PBS) був від компанії Caisson Laboratories, Inc. (Норт-Логан, Юта, США).

Миші-пластівці Foxx1 (f-Fox01) та миші з подвійним флоксом Irs1/Irs2 (df-Irs) були розміщені та розміщені, як описано вище. 15, 16, 52 Коротко кажучи, мишей розміщували у пластикових клітинах на 12-годинному світло-темному фотоциклі із вільним доступом до води та регулярним харчуванням. До експериментів з лікуванням там зважували самців мишей (віком від 14 до 16 тижнів) та вимірювали жирову масу за допомогою ЯМР-аналізатора Bruker Minispec LF90 (Bruker Optics, Billerica, MA, USA). Потім мишей переводили до кімнати біобезпеки 2 (BSL2) і вводили Там (1 мг/20 г маси тіла) або носій (соняшникова олія) шляхом ін’єкції ІР (один раз на день протягом 5 днів поспіль). Після введення Там клітини міняли кожні 2 дні до 2-го тижня, коли мишей переселяли до приміщення BSL1 і вимірювання маси жиру в тілі продовжували. Залежно від експериментальної установки, мишей зважували і жертвували для видалення тканини для швидкого заморожування в рідкому азоті через 2 або 6 тижнів після обробки Там. Усі процедури керувались керівництвом NIH та затверджувались Комітетом з технічного обслуговування та використання штату Вірджинія.

Культура клітин та лікування

Вимірювання АФК

АФК в адипоцитах та жировій тканині вимірювали, як описано раніше, 54, 55 за допомогою проникного для клітин барвника 5,6-карбокси-2 ', 7'-дихлорфлуоресцеїну діацетату (карбокси-DCFDA, молекулярні зонди, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) Негайно заморожені жирові тканини зважували і переносили в забуференне середовище (5 ммоль/л HEPES у PBS) для швидкого розморожування для поліпшення дифузії зонда. Після швидкого розморожування середовище викидали. Зразки піддавали впливу 8 мкМ карбокси-DCFDA у свіжому середовищі та інкубували при 37 ° С протягом 45 хвилин при перемішуванні. Потім середовище видаляли, а зразки додатково інкубували в буфері для лізису (0,1% SDS, Tris-HCl, pH 7,4) протягом 15 хвилин при 4 ° C. Після гомогенізації зразки центрифугували при 16000 xg протягом 20 хвилин при 4 ° C. ° C. Супернатанти збирали і піддавали флуоресцентному аналізу при 530 нм з збудженням при 485 нм, використовуючи гібридний багаторежимний зчитувач мікропланшетів Synergy H4 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

Для вимірювання АФК у адипоцитах 3T3L1 збирали 1-5 × 106 клітин типсином і тричі промивали холодним PBS, після чого інкубували з 8 мкМ карбокси-DCFDA у свіжому середовищі (5 ммоль/л HEPES у PBS) та інкубували при 37 ° С протягом 45 хвилин при перемішуванні. Потім середовище видаляли, а зразки додатково інкубували в буфері для лізису PLC: 15, 52 (30 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10% гліцерину, 1% Triton X-100, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ EGTA, 10 мМ NaPPi, 100 мМ NaF, 1 мМ Na 3 VO 4), доповнений коктейлем інгібітора протеази (Roche, Branchburg, NJ, USA) та 1 мМ PMSF протягом 15 хвилин при 4 ° C. Після гомогенізації зразки центрифугували при 16000 xg протягом 20 хвилин при 4 ° C. Супернатанти збирали і піддавали флуоресцентному аналізу при 530 нм з збудженням при 485 нм, а загальний білок визначали за допомогою аналізу білка постійного струму (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) на гібриді. багатомодовий зчитувач мікропланшетів Synergy H4 (BioTek) Instruments, Inc.). Рівні АФК нормалізувались до загального білка для кожного клітинного блюда.

Вестерн-блот

Для приготування тканинних лізатів швидкозаморожені жирові тканини зважували та гомогенізували за допомогою Bullet Blender (Next Advance, Averill Park, NY, USA) в буфері для лізису PLC, доповненому коктейлем інгібітора протеази (Roche), 1 мМ PMSF, 10 мкМ TSA . (Trichostatin A, Selleckchem, Houston, TX, USA) та 5 мМ нікотинаміду (Alpha Aesar, Ward Hill, MA, США). 15, 52 Для клітинних лізатів адипоцити 3T3L1 промивали крижаним PBS і гомогенізували кулевим блендером. Загальні концентрації білків у лізатах визначали, використовуючи аналіз білка постійного струму (Bio-Rad). Вестерн-блот і аналіз зображень проводили, як описано вище. Каталожні номери та постачальники антитіл такі: розщеплений кролячий каспаза-3 mAb (9664) та антитіло LC3B (# 2775) від Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); Антитіла до PPAR-гамма (MA5-14889) та GAPDH (MA5-15738) від Pierce (Рокфорд, Іллінойс, США) або Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA); і антитіло до HO1 (3391-100) від Biovision (Мілпітас, Каліфорнія, США).

Статистичний аналіз

Усі результати виражаються як середнє значення ± SD і аналізуються дисперсійним аналізом для визначення значень Р; P Карбокси-DCFDA

5,6-карбокси-2 ', 7'-дихлорфлуоресцеїндіацетат

розщеплена каспаза 3

Миші Irs1/Irs2 з подвійним валянням

епідидимальна біла жирова тканина

коробка виделки O1

Флокс-миші FoxO1

гемоксигеназа 1

субстрат рецептора інсуліну

кон'югат білка 3A/1B легкого ланцюга з 3-фосфатидилетаноламіном з мікротрубочками

гамма-рецептор, що активується проліфератором пероксисоми