рекомбінази

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Суїцидальна дія різних злитих білків ТЗ
  • Специфічна для сайту геномна інтеграція в клітинах HEK293, опосередкована інтегразою phiC31
  • Спеціальна інтеграція та висічення рекомбіназ у первинних ізольованих фібробластах плода великої рогатої худоби
  • обговорення
  • методи
  • Етичне твердження
  • Плазмідна конструкція
  • Культура клітин та трансфекція
  • Вестерн-блот
  • Аналіз цитотоксичності
  • Аналіз проточної цитометрії
  • Приготування рекомбінантного клітинопроникного білка та трансдукції білка
  • Південна пляма
  • Статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Файли зображень
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Аграрна генетика
  • Генна інженерія
  • Генетичні вектори

реферат

Доставка генів, опосередкована інтегразою PhiC31, широко використовується в генотерапії тварин і трансгенезі. Однак випадкові випадки інтеграції спостерігаються при опосередкованій phiC31 інтеграції в різні типи клітин ссавців; як результат, ефективність псевдо інтеграції сайтів та оцінки інтеграції для конкретного сайту порушена. Для вдосконалення цієї системи ми використовували ген злиття attB-TK як негативний маркер відбору, усуваючи випадкову інтеграцію під час трансфекції, опосередкованої phiC31. Ми також відібрали систему відбору та плазмідний бактеріальний кістяк, використовуючи дві інші специфічні для сайту рекомбінази, Cre та Dre. Таким чином, ми генерували чисті трансгенні клітини фібробластів плоду бика без маркера селекції та плазміди з бактеріального скелета. Ці чисті клітини використовувались як донорські ядра для перенесення соматичних клітин (SCNT), що свідчить про подібну компетентність розвитку ембріонів SCNT як нетрансгенних клітин. Тому сучасна система доставки генів сприяла розвитку генної терапії та сільськогосподарських біотехнологій.

Інтеграза PhiC31 - це ДНК-рекомбіназа, отримана з фагу Streptomyces φ C31 1. Цей фермент може опосередковувати рекомбінацію між двома послідовностями, attB і attP 2, 3. Інтеграза PhiC31 не вимагає ідеального збереження ділянки attP для досягнення рекомбінації між сайтами attP та attB 4. Ці недосконалі сайти attP або сайти псевдо attP нагадують сайт attP дикого типу 5 і присутні в транскрипційно активних областях геному 6. Інтеграза PhiC31 розпізнає відносно короткі, але дещо специфічні послідовності в геномах ссавців 7. Таким чином, система інтегрази phiC31 демонструє кілька характеристик, таких як місцева специфічність та односпрямована рекомбінація, і дозволяє успішно використовувати інтегразу в різних галузях дослідження, включаючи доставку генів in vitro 5 або in vivo 8, генну терапію 9 та отримання трансгенні тварини 10. .

Ми представили підхід, який використовував негативну стратегію відбору для виключення випадкової інтеграції під час трансфекції, опосередкованої phiC31. Ми також відібрали систему відбору та плазмідний бактеріальний кістяк, використовуючи дві інші рекомбінази, а саме Cre та Dre.

результат

Суїцидальна дія різних злитих білків ТЗ

(А) Схема різних сплавлених конструкцій ТЗ. ЦМВ: цитомегаловірус, негайний ранній промотор; loxP та rox: цілі розпізнавання рекомбіназ Cre та Dre; attB35 і attBwt: мінімальний дробовий розмір та загальна довжина сайту attB дикого типу; G4S × 3: (Gly 4 Ser) 3 гнучкі лінкери; P2A: саморозщеплюється пептид 2A, отриманий із свинячого тешовірусу-1; ATG: кодон ініціації, оточений традиційною послідовністю Козака; контроль: порожній вектор pIRES2-AcGFP1-Nuc. (B) Вестерн-блот-аналіз клітин HEK293, трансфікованих різними конструкціями ТЗ. Блот досліджували поліклональними антитілами проти HSV-1 TK або GAPDH. Зірки вказують на ймовірні продукти протеолітичної деградації. Повнометражні блоки показані на додатковому малюнку S8. (C) Імунофлуоресцентне фарбування клітин HEK293 через 48 годин після трансфекції. Ядра фарбували DAPI (синій); Білки ТЗ (червоні) фарбували анти-ТЗ антитілами та візуалізували міченими Cy3 вторинними антитілами. Шкала шкали = 10 мкм. (D) Відносна життєздатність клітин HEK293, трансфікованих різними конструкціями ТЗ. Відібрані FACS трансфіковані клітини піддавались різним концентраціям нуклеозидного аналога GCV протягом 4 днів. Цитотоксичність визначали за допомогою аналізу WST-1. "Контроль" являє собою клітини, трансфіковані порожнім вектором pIRES2-AcGFP1-Nuc.

Повнорозмірне зображення

Для дослідження суїцидальної дії різних злитих білків ТЗ проводили аналіз цитотоксичності на клітинах HEK293. Результати показали, що всі конструкції ТЗ, за винятком контрольних трансфікованих клітин HEK293, були чутливими до лікування ганцикловіром (GCV) у високих концентраціях (рис. 1D). На відміну від цього, контрольна клітинна лінія вектора, трансфікована pIRES2-AcGFP1-Nuc, була високостійкою до 10 мкг/мл GCV і демонструвала 2,76% загибелі клітин. При 0,1 мкг/мл GCV 51,1 ± 4,0% клітин були мертвими в групі, трансфікованій attBrP2ATK, порівняно з 28,5 ± 7,7% (P = 0,001) та 34,8 ± 4,5% (P = 0,032) смертності клітин у attBrTK- і attBrG4STK. - трансфіковані клітини після періоду лікування 4 д. Цей результат показав, що клітини, трансфіковані attBrP2ATK, були більш чутливими до GCV, ніж інші дві клітини, трансфіковані конструкцією TK, злитою з attB, при відносно низьких концентраціях GCV. Для порівняння, клітини, трансфіковані attBrP2ATK, показали подібну життєздатність, як клітини, трансфіковані attB35TK і wt-TK, у яких білок дикого типу експресувався в обох групах. Тому ми вибрали attBrP2ATK як репрезентативну конструкцію TK, злиту з повною довжиною attB для наступних досліджень.

Специфічна для сайту геномна інтеграція в клітинах HEK293, опосередкована інтегразою phiC31

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Спеціальна інтеграція та висічення рекомбіназ у первинних ізольованих фібробластах плода великої рогатої худоби

Промотор CMV був замінений на промотор CAGGS для підтримки високого рівня експресії трансгену ТЗ. Результатом було створення вектора інтеграції плазміди pCAG-attBrP2ATK (Фігура 2А). Ми також додали фланг-сайт багаторазового клонування rox і loxP (MCS), щоб ввести бажані гени (GOI), а потім замінили касету IRES-AcGFP-Nuc касетою, що експресує EGFP, керованою промотором EF1α. Щоб визначити ефективність експресії новоствореного вектора інтеграції, ми тимчасово трансфікували клітини HEK293, використовуючи конструкції TK, керовані або промотором CMV, або промотором CAGG. Вестерн-блот-тест показав, що продукт ТЗ сильно експресується під промотором CAGGS (додатковий малюнок S2A). Клітини спостерігали за допомогою флуоресцентної мікроскопії через 48 годин після трансфекції. Трансфіковані pCAG-attBrP2ATK клітини HEK293 демонстрували сильний флуоресцентний сигнал GFP (додатковий малюнок S2B). Цей результат запропонував відповідну функцію для промотору EF1a. Тому pCAG-attBrP2ATK використовували в подальших експериментах, що, ймовірно, призвело до сильної експресії трансгену в первинних ізольованих клітинах.

Повнорозмірне зображення

Одноразовий безпечний порт з інтегрованих чистих трансгенних клітин без маркерів селекції та вирізаної кістки векторів використовувались як донори ядер для отримання трансгенних зародків SCNT. Крім того, звичайні плодові бичачі фібробласти, отримані від того самого плода та з однаковим номером пасажу, використовувались як контроль для дослідження впливу трансгенних процедур на потенціал розвитку ембріонів SCNT. Коли вирізані клітини використовувались як донори ядер у порівнянні з нетрансфікованими бичачими бичачими клітинами фібробластів великої рогатої худоби, суттєвих відмінностей у швидкості розщеплення та утворенні бластоцисти не спостерігалося (77, 4 ± 2,6% проти 78,6 ± 4,3%, Р = 0,7 при коефіцієнт розщеплення, 32,6 ± 2,9% проти 36,3 ± 4,0%, Р = 0,3 для швидкості утворення бластоцисти). Подібні показники вагітності спостерігались також після перенесення ембріонів порівняно з контрольною групою (25,9 ± 2,4% проти 32,3 ± 4,7%, Р = 0,1).

обговорення

Ми запровадили нову стратегію, яка може бути використана для вибору опосередкованої phiC31 псевдоспецифічної інтеграції із випадкової інтеграції та отримання чисто трансгенних клітин без маркерів селекції та магістральної основи. Ми використовували інтегразу phiC31 для досягнення специфічної для сайту геномної інтеграції в псевдосайти. Ми також використовували злиті білки attB-TK як негативні маркери відбору для виключення випадкової інтеграції. Чисті трансгенні клітини отримували шляхом сортування клітин, активованих флуоресценцією, після обробки Cre- та Dre-рекомбіназою.

Нарешті, це дослідження представляє просту опосередковану phiC31 стратегію інтеграції трансгену в безпечну геномну гавань, запобігаючи випадковій інтеграції та поєднуючи трансдукцію клітин-проникних білків та сортування клітин, що активуються флуоресценцією, для видалення системи відбору та основи вектора. Цей невірусний підхід забезпечує просту і безпечну альтернативу для виробництва чистих трансгенних клітин без маркерів селекції та плазмідної бактеріальної основи. Тому наша стратегія є цінним інструментом у генній терапії та трансгенезі тварин.

методи

Етичне твердження

Процедура експерименту була затверджена Комісією з догляду за тваринами при Коледжі ветеринарної медицини Північно-Західного університету A&F у Китаї. Бичачі яйця забитих зрілих корів збирали з бойні Тумен (Сіань, Китай). Новонароджених самок голштинських телят використовували для отримання клітинних культур донорів-ядерців, а корови великої рогатої худоби (Yangling Keyuan Cloning Co., Ltd., PR China) використовували як приємних тварин.

Плазмідна конструкція

Було створено кілька конструкцій термоядерного синтезу, як описано в ДОДАТКОВІ МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ (Рисунок 1А). Послідовності праймерів, сайти рестрикції та шаблони, використані в дослідженні, перелічені в таблиці SI.

Культура клітин та трансфекція

Клітини HEK293 вирощували в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (DMEM; GIBCO, Карлсбад, Каліфорнія), доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою (FBS; GIBCO) при 37 ° C у зволоженій атмосфері з 5% CO 2. Фетальні бичачі фібробласти були виділені із плоду Гольштейна (50-60 днів; Yangling Keyuan Biotechnology Inc., Китай) шляхом дезагрегації тіла без голови та нутрощів; Потім фібробласти культивували в DMEM з додаванням 10% FBS при 38,5 ° C у зволоженій атмосфері з 5% CO 2. Фібробласти великої рогатої худоби у місцях злиття збирали трипсинізацією і піддавали пасажу або кріоконсервації.

Трансфекцію клітин проводили, як описано раніше 20. Коротко кажучи, клітини HEK293 або плодові бичачі фібробласти ресуспендували в 0,2 мл розведеного робочого буфера для електропорації, що містить лише донорську плазміду (5 мкг) або донорську плазміду (5 мкг) з мРНК phiC31 (1 мкг). Електропорацію проводили за допомогою BTX ECM2001 (BTX, Сан-Дієго, Каліфорнія), встановленого на один імпульс 2 мс при 510 В. Через 24 години після електропорації клітини розбавляли в 10-сантиметровій посудині, що містить свіже середовище, доповнене G418 (400 мкг)/мл до 600 мкг./Мл) або G418/GCV (від 400 мкг/мл до 600 мкг/мл та від 1 мкг/мл до 10 мкг/мл) для відбору стабільно трансфікованих клітин. Відбір проводили протягом 12-15 днів, поки окремі колонії не були зібрані та підраховані.

Вестерн-блот

Експресія білка тимідинкінази була виявлена ​​за допомогою вестерн-блот. Клітинні лізати готували з клітин HEK293, трансфікованих контролем порожнього вектора (pIRES2-AcGFP1-Nuc) або різних конструкцій ТЗ (attB35TK, attBrTK, attBrG4STK, attBrP2ATK та wt-TK). Через 48 годин після трансфекції клітини збирали і ресуспендували у солі, забуференному фосфатом (PBS). Загальний білок (10 мкг) завантажували в одну смужку на 12% гель SDS-PAGE. Гель переносили на мембрани з фтористим полівінілідену (Millipore, Billerica, MA) та піддавали вестерн-блот-аналізу згідно зі стандартним протоколом. Козині поліклональні антитіла проти тимідинкінази HSV-1 (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Каліфорнія) та мічений HRP віслючий анти-козячий IgG (H + L; 1: 1000; Бейотіме, Цзянсу, Китай). були використані для виявлення продуктів ТЗ. Кроликове поліклональне антитіло проти GAPDH (1: 1000, Sigma) та мічений HRP козячий анти-кролячий IgG (H + L; 1: 1000; Beyotime) використовували для виявлення GAPDH, який використовували як внутрішній контроль.

Аналіз цитотоксичності

Клітини HEK293 трансфікували різними конструкціями ТЗ у відсутність інтегрази phiC31. Трансфіковані клітини визначали за допомогою експресії GFP та сортували за FACS, виконаним через 48 год після трансфекції. Відсортовані GFP-позитивні клітини висівали в 96-лункові планшети при щільності клітин 5,0 × 10 3 клітин/лунка. Концентрації GCV (0,01, 0,1, 1, 10 та 20 мкг/мл) додавали до трансфікованих клітин. Через 4 дні вбивчий ефект GCV вимірювали за допомогою набору для аналізу проліферації та цитотоксичності WST-1 (Beyotime) відповідно до інструкцій виробника.

Аналіз проточної цитометрії

Через 2 або 5 днів після трансфекції 2 × 10 7 клітин з кожної культури, трансфікованої лише конструкціями злиття TK, або злиті конструкції TK та мРНК phiC31 збирали шляхом трипсинізації та повторно суспендували в PBS, що містить 2% FBS. Потім клітини аналізували за допомогою проточної цитометрії для визначення експресії GFP. Проточний цитометричний аналіз проводили за допомогою BD FACSAria (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія).

Приготування рекомбінантного клітинопроникного білка та трансдукції білка

pET-28a (+) - Плазміди His-TAT-Dre-NLS були сконструйовані шляхом клонування послідовності TAT-Dre-NLS у вектор експресії His6 pET-28a (+). Вектор експресії pET-28a (+) - His-NLS-TAT-Cre 20 та pET-28a (+) - His-TAT-Dre-NLS були використані для трансформації штаму кишкової палички BL21 (DE3) окремо для IPTG-індукованої експресії білків Cre та Dre з міткою His. Експресію та очищення His-мічених білків Cre та Dre проводили згідно детального протоколу, описаного раніше 20. Концентрації білка вимірювали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Beyotime). Для експериментів з трансдукцією білка 2 × 10 6 клітин висівали на 24-лунковий планшет і вирощували протягом 24 годин. Білки, що пронизують клітини, стерилізували фільтруванням з використанням фільтра 0,22 мкм (Millipore). Клітини інкубували протягом 4 годин у середовищі, що містить 100 мкг/мл His-NLS-TAT-Cre та 100 мкг/мл білків His-TAT-Dre-NLS. Після трансдукції клітини промивали PBS і культивували протягом 72 годин у нормальному середовищі перед проведенням проточного цитометричного аналізу.

Південна пляма

Приблизно 10 мкг до 20 мкг геномної ДНК з нетрансфікованих клітин або стабільно трансфікованих колоній клітин перетравлювали BamHI та HindIII (New England Biolabs, Пекін, Китай) протягом ночі та розчиняли за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. ДНК переносили, піддавали ультрафіолетовому зшиванню на нейлоновій мембрані Hybond N + (Рош, Південний Сан-Франциско, Каліфорнія) і гібридизували з ТК-зондом або нео-зондом, генерованим за допомогою набору для маркування та виявлення DIG High Prime (Рош). Послідовності праймерів були перераховані наступним чином: для зонда ТК, 5′-CAGCAAGAAGCCACGGAAGT-3 ′ (вперед) і 5′-GCCCGAAACAGGGTAAATAACG-3 ′ (реверс); для неозонда, 5′-GGATTGCACGCAGGTTCTCCG-3 ′ (вперед) і 5′-CGCCGCCAAGCTCTTCAGCAA-3 ′ (реверс).

Статистичний аналіз

Кожен експеримент проводився щонайменше 3 рази. Дані аналізували за допомогою SPSS 20.0 (IBM Corporation, Somers, NY, USA) з односторонніми тестами ANOVA та найменш значущими різницями. Дані були представлені як середнє значення ± SEM. P