1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO DE PUNO ФАКУЛЬТЕТ БІОЛОГІЧНИХ НАУК ПРОФЕСІЙНА ШКОЛА БІОЛОГІЇ АНТИМІКОТИЧНИЙ ЕФЕКТ У ВІТРО ЕФІРНОГО МАСЛА cinnamomum zeylanicum CANELA НА Candida albicans BRESA

altiplano

2 UNIVERSIDAD NACIONAL DF.L ALTIPLANO DE PUNO FACULTY O [BIOLOGICAL CIINCLES rmljila PROFESSIONAL DE BIOLOGY IN VffRO ANTIMYCOTIC EFFECT OF THE ESFENTIAL OIL OF C1 " " "'1mum zeylanic11m/CISELJCa bIStI A l'oii.: 6r. Ol.lNl) A HU A RACHA YUCRA l'ara Ol'TAll: L TiTUW PMOFTSIONAI, FROM: LICF.NOADO IN BIOLOCIA APM0BAD0 BY REURISOM CONFOK AOO Автор: PRESIDLJriTE D.SC. ДАНТФ. JONI CHOQUEHUANCA PANCU.S PRJMER MIF.MBRO SEGUNl> O WED.1 \ 1.BRO DIRECTOR I ASF.SOR Ftt - "tad6e: 02 df'mplif'mbn: dri 2019 Площа: Cicn. Il, s Btomtdica.s Тема: Bio «x: oologia. Vegclal

3 ПОСВІТЛЕННЯ Всемогутньому Богу за те, що Він дав мені буття і мудрість; Це завжди допомагало мені йти вперед, у всі часи. Особливо в найскладніших. Я присвячую цю роботу своїм дорогим батькам, Ангелу Флавіо Уарача Квіспе та Фіделі Сімоні Юкра Кутіпа за їх безумовну допомогу, підтримку та мотивацію рухатися вперед і досягти моїх цілей. До всієї моєї родини, яка підтримувала мене і завжди мені довіряла, своїми заохочувальними словами та посмішками вони мотивували мене продовжувати йти.

4 ДЯКУЮ Національному університету Альтіплано-де-Пуно за те, що він дав мені можливість сформувати своє майбутнє, особливо у професійній кар'єрі біології та викладачів за їх знання, отримані під час мого професійного навчання. Я висловлюю свою особливу подяку усім працівникам відділення патології та клінічної лабораторії лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона - Пуно за те, що дозволили мені проводити мою дослідницьку роботу в цьому закладі, оскільки завдяки їхній допомозі та внеску вони допомогли мені збільшити знання при виконанні моєї дипломної роботи.

5 ЗАГАЛЬНИЙ ПОКАЗНИК ЗАГАЛЬНИЙ ПОКАЗНИК. 5 ПОКАЗНИК ФІГУР. 7 ІНДЕКС ТАБЛИЦ ІНДЕКС АКРОНІМІВ РЕЗЮМЕ I. ВСТУП Загальна мета Конкретні цілі II. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ТЕОРЕТИЧНА РАМКА Лікарські рослини Ефірні олії Використання масел Ефірні олійні методи екстракції Cinnamomum zeylanicum Опортуністичний мікоз Candida albicans Клінічні прояви Лабораторна діагностика Лікування III. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ Область дослідження Тип дослідження Населення та зразок Дизайн дослідження. 38

6 3.5. Методологія a. Статистичний аналіз IV. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ V. ВИСНОВКИ VI. РЕКОМЕНДАЦІЇ VII. ЛІТЕРАТУРА VIII. ДОДАТКИ. 66

9 Рисунок 26. Позитивний контроль (флуконазол). Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом листопада 2018 року по лютий,

11 ІНДЕКС АКРОНІМІВ HMNB Лікарня CMI ВООЗ Мануель Нуньєс Бутрон Всесвітня організація охорони здоров’я Мінімальна інгібуюча концентрація мкл Мікролітрів мм CMF Міліметри Мінімальна концентрація грибка мкг Мікрометри мл Мілілітри Сантиметри мкм Мікрометри C Градуси Цельсія ECM KOH Внутрішній Кислот Матриця Кислота Сад Кислота Матриця Кислота Матриця Кислота Матриця Кислота Матриця Кислота Матриця Кислота Саду Підрозділи, що формують колонії

16 1.1. Загальна мета Оцінити протигрибкову активність in vitro ефірного масла cinnamomum zeylanicum на Candida albicans Конкретні цілі Порівняти інгібуючий ефект in vitro найкращої інгібуючої концентрації ефірної олії Cinnamomun zeylanicum та антибіотика флуконазолу на Candida albicans. Визначте мінімальну інгібуючу концентрацію (MIC) ефірної олії Cinnamomum zeylanicum cinnamon у концентраціях 25%, 50%, 75% та 100% на Candida albicans. Гіпотеза Ефірна олія кориці Cinnamomum zeylanicum виявляє інгібуючий ефект in vitro на штами Candida albicans. Можливо визначити мінімальну інгібуючу концентрацію (MIC) ефірної олії кориці при концентраціях 25%, 50%, 75%, 100%. 16

24 Дистиляція після мацерації Цей метод застосовується для вилучення олії з цибульних цибулин, насіння мигдалю, цибулин часнику та листя берези. З іншого боку, ароматичні рослини повинні бути піддані процесу мацерації гарячою водою, щоб допомогти відокремити олію, оскільки його леткі сполуки пов'язані з глікозильованими компонентами (Albarracín & Gallo, 2003). Рисунок 2. Дистиляція водяною парою або вологою парою (Vidal, 2015) Cinnamomum zeylanicum Кориця належить до сімейства Lauraceae, з роду Cinnamomum, що налічує приблизно 250 видів, трьома найважливішими сортами, з яких добувають коричне масло, є C. zeylanicum, C. cassia Blume та C. camphora L (Санчес, 2013). Кориця має біологічну дію, таку як знеболення, вона є антисептичною, спазмолітичною, афродизіаковою, в’яжучою, ветрогонною, кровоспинною, інсектицидною та паразитичною (González, 2010). Синонімія Загальна назва: Цейлонська кориця, кориця, каннеллоні (Aizaga, 2017). Німецька: zimt англійська: кориця італійська: cannella каталонська: canyella баскська: kanelondo Гало: caneleiro 24

26 Кориця з Шрі-Ланки є улюбленою для європейців, оскільки вона м’якша, має солодкуватий смак і дорожча (Об’явлення, 2017). Таксономічна класифікація Королівство: Plantae Відділ: Magnoliophyta Клас: Magnoliopsida Порядок: Laurales Родина: Lauraceae Рід: Cinnamomum Вид: Cinnamomum. zeylanicum Загальна назва: Кориця Джерело: (Aizaga, 2017) Хімічний склад олії кориці Згадуючи хімічний склад олії кориці, ми маємо на увазі компоненти кори, що їх представляє кориця (aizaga, 2017), де кількість хімічних речовин переважно відповідають альдегіду кориці, евгенолу, феландрену, ліналоолу, бензальдегіду, каріофілену, бензойній кислоті та бензилциннамату ((Luis, 2017), ми також можемо згадати речовини, які присутні в менших кількостях, такі як: дубильні речовини, кумарин, цукри та смола, також крохмаль, слиз, дубильна кислота, мінеральні матеріали та флавоноїди, одна з цих речовин є тією, що відповідає забезпеченню протигрибкового ефекту (padrón, 2010) Таблиця 1. Компоненти кориці Джерело: (Sanchez, 2013; (Brand, 2013) 26

27 Хімічна структура Будова деяких компонентів кориці (Cava, 2013) Цинамальдегід Евгленол Катехін Поціанідин Сафрол Механізм дії Таким чином, як коричне масло діє, відбувається індукція апоптозу, що спричиняє загибель клітин, отже, це генерує некроз шляхом процесу шляхом яким порушується мітохондріальна функція дріжджових клітин, для чого це призведе до збільшення проникності та елімінації іонів з мембрани чутливої ​​клітини гриба. Було навіть показано, що кориця виявляє цитотоксичну активність у різних ракових клітинах ((Aizaga, 2017). Індукційний ефект може тривати до 24 годин після впливу. Він впливає на дріжджі більше, ніж на бактерії; без Однак, якщо протиставити його ефекти ефектам від інших масел кориця має більшу протигрибкову активність (Sanchez & Luján, 2013). 27

31 цитоплазма має інвагінації у вигляді борозенки товщиною від 200 до 300 мм, де вона має 2 відділення зі стероїдами та білками, крім того, контролюється проникність клітин та синтез клітинної стінки, що дуже важливо, оскільки ліки (антибіотики та протигрибкові засоби) використовуються для протидії цьому, вони діють на цьому рівні. Він також містить ферменти, які відповідають за синтез клітинної стінки, саме тому, коли препарат діє на цитоплазматичну мембрану, він автоматично зменшує синтез клітинної стінки (Aguilar, 2016). Клітинна стінка гриба. Показано суперпозицію елементів маннану, глюканів, хітину та білкових елементів. Білки, що утворюють комплекси з маннаном (маннопротеїни), виходять за межі клітинної стінки. Малюнок 3. Клітинна стінка дріжджового грибка, показує суперпозицію елементів маннану, глюканів, хітину та білкових елементів. Джерело: Мікробіологія (Райан, 2012). 31

33 2. Поверхнева інфекція: проникнення епітелію є важливим на цій стадії шляхом розкладання білків-господарів гідролітичними ферментами та утворення гіфалів. 3. Глибока інфекція: бере участь проникнення тканин, інвазія судин та ухилення імунітету через гідролітичні ферменти, а також утворення гіф. 4. Дисемінована інфекція: Candida albicans здійснюється шляхом приєднання до ендотелію, зараження тканин хазяїна, активації системи згортання шляхом втручання адгезинів, гідролітичних ферментів, повторного утворення гіф та зміни фенотипу. Дослідження in vitro на тваринах та людях стосуються протеаз, таких як (De la Calle et al, 2012): Рисунок 4. Етапи зараження Candida albicans та механізми вірулентності, що беруть участь у кожній стадії (De la Calle et al. Al, 2012). 33

37 III. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 3.1. Зона дослідження кори коричної кориці була придбана у Jr. Lima N 231 поблизу ринку Санта-Барбара в місті Хуліака вранці в секції спецій. Отримання ефірної олії кориці Cinnamomum zeylanicum проводилося в лабораторії плодоовочевої майстерні Професійної школи агропромислового машинобудування Національного університету Альтплано. Штам Candida albicans отримано з обласної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона Пуно. Протигрибковий вплив ефірної олії кориці Cinnamomum zeylanicum на штами Candida albicans було здійснено в клінічній патологічній службі регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія міста Пуно (рисунок 6). Рисунок 6. Район видобутку ефірної олії кориці та проведення розслідування (лікарня Мануель Нуньєс Бутрон) Пуно протягом місяців листопада 2018 року - лютого

39 Таблиця 2. Дизайн дослідження для порівняння in vitro інгібуючої дії найкращої інгібуючої концентрації ефірної олії Cinnamomun zeylanicum та антибіотика флуконазолу на Candida albicans. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців листопада 2018 р. По лютий р. Для визначення протигрибкової активності ми працювали з 30 експериментальними одиницями, складеними з 5 повторень для кожної використаної дози, крім того, позитивний контроль був використаний комерційний антибіотик флуконазол та негативний контроль алкоголю для Candida albicans. Таким чином, що вони служили для протиставлення інгібуючої дії, оскільки вже відомо, що зазначені мікроорганізми чутливі до цих антибіотиків. Таблиця 3. Розробка експерименту, концентрації та кількість повторень для знаходження мінімальної інгібуючої концентрації (MIC). 39

47 Farland (рисунок 16), підготовлений посівний матеріал висівали за допомогою смугастого тампона на пластинах, що містять агар Saboraud Dextrose Agar плюс коричне ефірне масло, приготовлене в різних концентраціях або дозах коричної олії 100%, 75%, 50%, 25 %, 12,5%, 6,25% та 3,125% відповідно, паралельно контрольну пластинку поміщали без будь-якої концентрації олії без обробки (контроль росту). Інкубацію проводили протягом 24 годин, після інкубації планшети досліджували на предмет розвитку, щоб продемонструвати, до якої мінімальної інгібуючої концентрації (MIC) Candida albicans проявляла чутливість. Статистичні тести не використовувались. 47

56 V. ВИСНОВКИ Найкращий інгібіторний ефект in vitro ефірної олії кориці Cinnamomun zeylanicum був отриманий у концентрації 100% (лікування Т4) з галою гальмування в мм, що представляє статистично значущу різницю порівняно з іншими методами лікування з меншими концентраціями. Так само не було статистично значущої різниці порівняно з контролем із застосуванням протигрибкового препарату флуконазолу, який отримав ореол гальмування в мм. Для мінімальної інгібуючої концентрації (MIC) ефірної олії кориці Cinnamomum zeylanicum, у концентраціях 25%, 50%, 75% та 100% на Candida albicans. Це 25% ефірної олії кориці, що було б найнижчою концентрацією, з якою вже відбувається інгібуючий ефект, оскільки зростання грибків не спостерігається. 56

57 VI. РЕКОМЕНДАЦІЇ Проведіть дослідження, що підтверджує протигрибкову активність ефірної олії кориці Cinnamomun zeylanicum проти різних лікарських засобів, що представляють терапевтичний інтерес, при лікуванні захворювань, спричинених кандидозом. Продовжити дослідження ефірної олії кориці (Cinnamomum zeylanicum) завдяки його протигрибковій дії проти росту Candida albicans, з випробуваннями на пацієнтах; дослідження in vivo. Продовжуйте дослідження протигрибкових продуктів, що містяться в ефірних оліях різних рослин, з метою сприяння дослідженню методів лікування на основі натуральних продуктів. Готуйте різні фармацевтичні форми відповідно до способу введення з використанням ефірної олії Cinnamomun zeylanicum (кориця) для клінічних випробувань у пацієнтів з дерматозом Candida albicans. Проведіть більше досліджень ефірного масла кориці, щоб його можна було використовувати в майбутній клінічній діяльності як можливе лікування. 57

66 ДОДАТОК A VIII. ДОДАТКИ Рисунок 8. Кора Cinnamomum zeilanicum (кориця), придбана в місті Хуліака, листопад Малюнок 9. Зважування кори кори. Лабораторія семінару фруктів та овочів, листопад Малюнок 11. Подрібнення кори кориці в лабораторії семінару фруктів та овочів, листопад Малюнок 10. Видобування ефірної олії кориці методом захоплення водяної пари. У лабораторії розмірів фруктів та овочів, листопад

67 Рисунок 12. Декантування олії кориці в лабораторії Taller de Frutas y Hortalizas, листопад, 2018 Рисунок 13. Отримання ефірної олії кориці в лабораторії Taller de Frutas y Vegetables, листопад, 2018 Рисунок 14. Концентрація олії ефірної кориці 100 %, 75%, 50%, 25%, позитивний контроль (флуконазол) та негативний контроль (алкоголь), Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, листопад 2018 - лютий 2019 Рисунок 15. Виділення Candida albicans штами, Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, листопад 2018 - лютий,

68 Рисунок 16. Підготовка шкали Мак-Фарленда. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців листопада 2018 р. - лютого, Малюнок 17. Спостереження за Candida albicans 40x, Служба клінічної патології Регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців з листопада 2018 року по лютий,

69 Рисунок 18. Обробка зразків для методу зародкової трубки, Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців листопада 2018 р. - лютого 2019 р. Рисунок 19. Спостереження мікроскопа при 40 х для Candida albicans, Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом листопада 2018 року по лютий,

70 Рисунок 20. Ореол інгібування при концентрації 50%. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців листопада 2018 р. - лютого, Малюнок 21. Ореол гальмування при концентрації 75%. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом листопада 2018 року по лютий,

71 Рисунок 22. Ореол інгібування при 100% концентрації. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців листопада 2018 р. - лютого 2019 р. Малюнок 23. Інокуляція штамів Candida albicans в декстрозний агар Саборо. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом листопада 2018 року по лютий,

72 Рисунок 24. Ореол інгібування при концентрації 25%. Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом місяців листопада 2018 року - лютого 2019 року Рисунок 25. Негативний контроль (алкоголь). Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом листопада 2018 року по лютий,

73 Рисунок 26. Позитивний контроль (флуконазол). Служба клінічної патології регіональної лікарні Мануеля Нуньєса Бутрона, мікробіологія, протягом листопада 2018 року по лютий,