ланцюга

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Сенсорні сигнали опосередковують полегшення або придушення годування
  • Схеми, що є основою полегшення живлення
  • Схеми, що є основою придушення потужності
  • Взаємне гальмування між нейронами NSM та RIM/RIC
  • Функція "переможець приймає всіх" центральної інтеграційної схеми
  • обговорення
  • методи
  • племені
  • Молекулярна біологія
  • Тести поведінки
  • Флуоресцентна візуалізація
  • Аналіз даних
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Поведінка тварин
  • Харчова поведінка
  • Сенсорні системи

реферат

Харчова поведінка модулюється навколишнім середовищем та внутрішніми фізіологічними умовами. Апетит зазвичай підтримується приємним запахом (або зовнішнім виглядом) їжі і руйнується поганим смаком. Насправді тварини сприймають одночасно декілька стимулів навколишнього середовища, і незрозуміло, як ці сенсорні входи інтегруються, і тому приймається рішення відповідно регулювати харчові звички. Тут ми показуємо, що харчові звички Caenorhabditis elegans можуть підтримуватися або привабливим запахом, або придушуватися репелентами. Виявивши мутантів, які є дефектними в сенсорно-опосередкованій регуляції годування, ми проаналізували центральну схему тригера, яка інтегрує два протилежні сенсорні входи і генерує бістабільний вихід гормону для регулювання харчової поведінки. Оскільки регулювання годівлі є основою для виживання тварин, ми припускаємо, що основна організаційна логіка, визначена тут у C. elegans, ймовірно, сходиться в різних філітах.

Тваринам доводиться стикатися зі складними змінами обставин. Ці фактори навколишнього середовища включають "хороші" та "погані" фізичні та хімічні подразники, такі як приємні та відразливі запахи, а також високі та низькі температури. Однак незрозуміло, як ці протилежні фактори модулюють поведінку.

Caenorhabditis elegans оснащений декількома сенсорними методами, які можуть виявити навколишнє середовище, включаючи запах, смак, осмолярність, температуру та механічний контакт. Він може відчути сотні водорозчинних і летких молекул, які можуть спричинити різні способи поведінки, такі як притягання, уникання, годування чи спаровування 1. Дві пари амфідних сенсорних нейронів, AWA та AWC, опосередковують хемотаксис до привабливих летких ароматів 2, тоді як інша пара хемосенсорних нейронів, ASH, опосередковує уникнення високої осмолярності, високої концентрації летких запахів, гарячих алкалоїдів (наприклад, хініну) та миючих засобів. 3, 4, 5. Неясно, наскільки привабливі та відразливі сенсорні сигнали інтегровані для регулювання поведінки тварин.

C. elegans живиться, енергійно перекачуючи глоткову трубку, що призводить до потрапляння бактерій, концентрації, подрібнення та проштовхування подрібненої суспензії в просвіт кишечника 6. Вибираючи швидкість відкачування як віднімання та вимагаючи C. elegans з атрактантами та репелентами, ми виявляємо, що атрактанти та репеленти полегшують та пригнічують годування у C. elegans. Крім того, ідентифікуючи та характеризуючи мутантів, які є дефектними при сенсорно-опосередкованому сприянні та придушенні годування, ми демонструємо молекулярний та нейронний ланцюг C. elegans, який інтегрує протилежні сенсорні входи в регулювання швидкості накачування. Замість лінійної суми сенсорних подразників ми виявляємо нелінійну інтеграцію в центральних нейросекреторних клітинах. Ми прийшли до висновку, що функція "переможець приймає всіх" центральної інтеграційної схеми забезпечує стабільну поведінку годування при наявності шумних стимулів навколишнього середовища.

результат

Сенсорні сигнали опосередковують полегшення або придушення годування

Спочатку ми перевірили, чи можуть такі прості організми, як глисти, змінити свою харчову поведінку у відповідь на подразники навколишнього середовища, подібні до людських. Ми атакували черв’яків або привабливими ароматизаторами, діацетилом та низькою концентрацією ізоамілолу 2, або репелентами, такими як хінін та висока концентрація ізоамілолу 7, 8. Ми виявили, що концентрація діацетилу 10% і більше збільшувала швидкість накачування на

25% - явище, яке ми називаємо легшим годуванням (рис. Ла). Полегшення годування також спостерігалося при низьких концентраціях ізоамілолу (розведення 10-4 - 10-5, додаткова фігура S1), аттрактанта, який виявляється переважно нейронами AWC 2. Крім того, ми спостерігали придушення годування, при якому швидкість відкачування була знижена до дуже низького рівня залежно від дози при високих концентраціях ізоамілолу або хініну (рис. 1а, б). На основі кривих доза-реакція ми вибрали концентрації 100, 100% та 5-10 мМ для діацетилу, ізоамілолу та хініну для наступних експериментів, якщо не зазначено інше. Ми вимірювали швидкість накачування між 5 і 10 хвилинами, коли подразники мали максимальний ефект (рис. 1в). Можливий вплив цих хімічних речовин на рух було виключено шляхом моніторингу вигинів тіла під час короткочасного або тривалого впливу хімічних речовин (додатковий малюнок S2).

Схеми, що є основою полегшення живлення

Потім ми досліджували сигнальні шляхи за різними сенсорними модальностями. Нейромедіатор 5-гідрокситриптамін (5-HT, серотонін) регулює поведінку та фізіологію, пов’язану з їжею, у різних видів хребетних та безхребетних 15, 16, 17, 18. Відомо, що 5-НТ збільшує швидкість відкачки за відсутності їжі 19, тоді як мутанти tph-1, які не здатні синтезувати 5-НТ, демонструють зменшене годування 17. Як повідомляється, за наявності їжі екзогенний 5-НТ (13 мМ) не стимулює перекачування 20. На відміну від цього ми спостерігали

Збільшення швидкості накачування на 25% при екзогенному введенні 2 мМ 5-НТ (рис. 2а), що узгоджується із спостереженнями, зробленими в дослідженні Шрінівасани та ін., 21, в якому використовували 5 мМ 5-НТ. Цікаво, що ми підтвердили, що лише низькі концентрації 5-НТ (2-5 мМ) можуть полегшити годування в присутності їжі (додатковий малюнок S8), припускаючи, що високі концентрації 5-НТ можуть спричинити адаптацію або автоінгібування регуляції харчування. запропонований Hobson et al. Діацетил-опосередковане, але не 5-НТ-опосередковане поліпшення накачування було скасовано у мутантів tph-1 (рис. 2а, b), що свідчить про участь 5-НТ у сенсорно-опосередкованому харчуванні. У гермафродіті C. elegans експресія tph-1 обмежена лише кількома серотонінергічними нейронами, такими як NSM, ADF та HSN 17, 22. Щоб локалізувати сайт вивільнення 5-HT, ми використовували нейронально-специфічні промотори для стимулювання експресії TPH-1 у мутантів tph-1. Відновлення tph-1 у підмножині клітин, які перекриваються серотонінергічними нейронами в NSM, врятованому сприянні годуванню (рис. 2в), припускаючи, що TPH-1 діє в нейронах NSM.

Стіл в натуральну величину

Схеми, що є основою придушення потужності

Однак інгібування накачування, індуковане хініном та ізоамілолом, було повністю заблоковане у мутантів tdc-1, тоді як накачування мутантів tbh-1 було лише частково пригнічено (рис. 3а та додатковий рис. S10a). tbh-1 кодує β-гідроксилазу ТА, необхідну для перетворення ТА в OA30. Ці результати узгоджуються з інгібуючою роллю TA/OA у регулюванні накачування 32 .

Взаємне гальмування між нейронами NSM та RIM/RIC

a - d ) Зразки часових курсів та статистики рівня кальцію NSM ( a, b ) та RIM ( c, d ) нейронів вільно переміщуються кормових тварин за відсутності (контроль) або наявності 100% діацетилу (червоного). і 5 мМ хініну (синій). Сірі рамки вказують тривалість застосування хімікату. ( e ) Здатність діацетилу інгібувати рівень кальцію в нейронах RIM була втрачена у мутантів tph-1 та mod-1, але врятована трансгенною експресією tph-1 у NSM та mod-1 у нейронах RIM/RIC. ( f ) Індуковане хініном інгібування рівня кальцію в нейронах NSM було скасовано у мутантів tdc-1 та ser-2, але врятовано трансгенною експресією tdc-1 у RIM/RIC та ser-2 у нейронах NSM. Ptdc-1 для RIM/RIC, Ptph-1 для NSM використовували як промотори. Статистика ( b, d - f ): * P

методи

племені

Штами C. elegans культивували в планшетах із середовищем для росту нематод (NGM) при 20 ° C з використанням бактеріальних клітин E. coli OP50 як джерел їжі згідно стандартних методів 39 .

Штами були отримані від CGC (//www.cbs.umn.edu/CGC/) та Національного проекту з біоресурсів (//www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp). Штами, використані або генеровані в цьому дослідженні, перелічені в додатковій таблиці S1. Тварин з подвійними та потрійними мутаціями з бажаною комбінацією мутацій підтверджували за допомогою ПЛР та секвенування. Всі трансгенні штами генерували, використовуючи опубліковані методи 40. Плазміди вводили при 50 нг мкл -1 разом з unc-122: rfp (20 нг мкл -1) як маркер спільної ін'єкції, якщо не вказано інше. Для кожного рятувального експерименту тестували принаймні три незалежні лінії.

Молекулярна біологія

Для виробництва конструкцій застосовували шлюзову технологію. Кодуюча послідовність GFP вектора pPD95.75 (подарунок від A. Fire) була замінена генами tdc -1 G-CaMP 2.0, TagRFP-T або C. elegans для створення серії модифікованих векторів. Касету attP1-ccdB-CmR-attP2 ампліфікували за допомогою ПЛР з pDONR221 (Invitrogen) оліго, що містить або рестрикційні сайти Hin dIII або Age I. Фрагмент PCR потім очищали гелем і субклонували в унікальні сайти Hin dIII і Age I в pPD95. .75 та інші модифіковані вектори, перераховані вище, для отримання модифікованих векторів входу до воріт.

Промотори tph-1, tdc-1, gcy-13, tbh-1 та mod-1 ампліфікували за допомогою ПЛР з геномної ДНК N2, використовуючи праймери, що містять залишки attB1 і attB2. Ці фрагменти ПЛР рекомбінували з сайтами attP1 та attP2 у модифікованих донорських векторах шляхом рекомбінантної реакції АТ. Таким чином, P tph-1: G-CaMP2.0, P tdc-1: G-CaMP2.0, P tph-1: GFP, P tdc-1: GFP, P mod - 1: Створено плазмідами TagRFP-T, Pgcy-13: tdc-1 та Ptbh-1: tdc-1. Довжини промоторів tph-1, tdc-1, gcy-13, mod-1 і tbh-1 складають 4, 5, 4, 4, 2, 3, 5, 5 і 4, 6 kb.

Для побудови плазміди P tph-1: ser-2 послідовність кДНК гена ser-2 C. elegans була субклонована в сайти SalI та KpnI вектора pPD49.26 (подарунок від A. Fire). Потім промотор tph-1 вставляли між сайтами SphI та Sal I вектора.

Для побудови плазміди P tdc-1: mod-1 фрагмент геномної ДНК 4073 п.н., що містить усі інтрони та екзони mod-1, ПЛР ампліфікували з геномної ДНК N2 і субклонували в сайти NheI та KpnI вектора pPD49.26. Потім промотор tdc-1 вставляли між сайтами BamHI та NheI у вектор.

Для побудови плазміди Ptph -1: glr -7 за допомогою ПЛР з генома ДНК N2 ампліфікували за допомогою ПЛР геномну ДНК-фрагмент 3657 п.н., що містить усі інтрони та екзони glr-7, і субклонували в сайти Nhe I та KpnI pPD49.26. Промотор tph-1 вводили в сайти MscI та NheI вектора.

Тести поведінки

Всі поведінкові тести проводились на молодих дорослих. Щоб перевірити швидкість накачування, ми виміряли час, необхідний для заповнення 20 насосів. Для кожної тварини реєстрували від чотирьох до шести вимірювань, а за кожен експеримент тестували принаймні 8-12 тварин, всі експерименти повторювали принаймні три рази. Щоб перевірити вплив різних летких хімічних речовин на модуляцію корму, добре годуваних молодих дорослих черв’яків переносили на нові насіннєві пластини з насінням OP50. Через 10 хвилин до кришки додавали 2 мкл летких хімічних речовин (діацетил або ізоамілол, усі від Sigma) і пластину герметично закривали протягом 5 хвилин, перш ніж реєструвати швидкість відкачування. Серотонін, ТА і ОА розчиняли в буфері М9 і розподіляли по харчових планшетах NGM з кінцевою концентрацією 2 мМ. Хінін розчиняли в буфері М9 при концентрації 5 мМ і висівали на планшети з НГМ. Молодих людей переносили на ці пластини NGM через 2 години і кількість насосів підраховували через 5 хвилин протягом 10 хвилин. Буфер М9 додавали в планшет для контролю.

Виключення 100% ізоамілолу вимірювали, як описано раніше 5, з незначними модифікаціями: добре нагодованих тварин переносили на харчові тарілки протягом 10 хвилин. Потім покритий скляний електрод 1 MQ занурювали у 100% ізоамілол і поміщали перед носом тварини передньої тварини на 2 с. Реакція окремих тварин протягом 4 с реєструвалася як позитивна (рух назад) або негативна (відсутність руху назад) реакція.

Тест на рух, що застосовувався тут, базувався на тесті, використаному в попередньому дослідженні 41. Коротко кажучи, контрольних тварин та тварин, що зазнали дії хімічних речовин, переносили на тарілки без їжі. Через 10 хвилин кількість перегинів переднього тіла підраховували з інтервалом у 20 с протягом 5 хвилин.

Флуоресцентна візуалізація

Флуоресцентні зображення G-CaMP2.0 були зроблені під флуоресцентним мікроскопом Zeiss Discovery V8 з об'єктивом x20. Молодих дорослих черв'яків, що експресують G-CaMP2.0 у нейронах NSM або RIM/RIC, переносили в нові посудини NGM, щеплені OP50. У кришці вирізали отвір і покрили покривним склом 00 мм 00 #, до якого додали 2 мкл летких хімічних речовин. Хінін додавали безпосередньо до агарової пластини. Потім пластини герметично закривали, і через 5 хвилин хімічної стимуляції знімали тіла клітин, коли швидкість накачування вже зросла (діацетил) або зменшилася (ізоамілол або хінін). Для вимірювання часового курсу Са 2+ використовували інвертований флуоресцентний мікроскоп Olympus IX81, оснащений об'єктивом × 20, NA0.75. Щоб утримувати рухомий нейрон хробака в полі зору зарядженого пристрою, ми використовували систему PhotoTrack від Applied Scientific Instrumentation (ASI, Eugene, USA) у поєднанні з XI стадіями ASY із замкнутим циклом 42. Флуоресценція нейронів G-CaMP2.0 NSM або RIM/RIC у вільно рухаються хробаках реєструвалась системою PhotoTrack за допомогою EM-CCD Andor Luca при частоті 2 Гц.

Колокалізація tdc-1: GFP та mod-1: TagRFP-T або tph-1: TagRFP-T та ser-2: GFP була досліджена за допомогою лазерної конфокальної мікроскопічної системи Andor Revolution XD на основі обертання - дискова конфокальна скануюча головка, CSU-X1 (Yokogawa Electric), під контролем програмного забезпечення Andor IQ 1.91. Конфокальний мікроскоп був побудований на інвертованому мікроскопі Olympus IX-71 (Olympus, Токіо, Японія), оснащеному об'єктивом x60 (числова апертура = 1,45, Olympus, Японія). Зображення демонстрували та аналізували за допомогою Image-J 1, 43b (Wayne Rasband, Національний інститут охорони здоров’я, США).

Аналіз даних

Аналіз даних проводили за допомогою IGOR Pro 5.01 (Wavemetrics, Портленд, ОР, США). Результати повідомляються як середні значення ± 10-12 тварин, якщо не вказано інше. Статистичну значимість оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента. Зірочками вказується статистична значимість: * P