ДИСЕРТАЦІЯ УНІВЕРСИТЕТСЬКОГО ДОКТОРА (PhD) Вивчення ролі оксиду азоту у розвитку інсулінорезистентності Агнес Байца Науковий керівник: д-р Золтан Сілвассі, доктор Угорської академії наук УНІВЕРСИТЕТ ДЕКОРАТИВНОЇ ДОКТОРАЛЬНОЇ ШКОЛИ ФАРМАЦЕВТИЧНИХ НАУК 2013 Дебрек

вивчення

ЗМІСТ 1. Скорочення 4. 2. Вступ 6. 2.1. Інсулінорезистентність 7. Інсуліновий рецептор 7. Дія інсуліну та передача сигналу 8. Визначення інсуліну 10. 10 . Нітрати 13. Механізм дії нітратів 14 Механізми толерантності до нітратів 15. Толерантність до нітратів та кардіопротекторні механізми 17. 2.3. Холецистокінін 18. Діяльність CCK та сигналізація 19. 3. Цілі 21. 4. Матеріали та методи 23. 4.1. Порівняння ефектів гострого та субхронічного (7 днів) лікування нітрогліцерином та дослідження розвитку інсулінорезистентності у насторожених кроликів 23. Хірургічне втручання 23. Внутрішньовенне застосування глюкози 24. Гіперінсулінемічний еуглікемічний затискач глюкози (HEGC) 24. Толерантність до гемодинамічного нітрату 24. Індукція гемодинамічного нітрату Статистичний аналіз 26. 4.2. Дослідження впливу толерантності до нітратів та потенційної ролі CCK на явище харчової сенсибілізації інсуліну у кроликів 26. Опис експерименту 26. Перевірка толерантності до нітратів 28. RIST (швидкий тест на чутливість до інсуліну) 28. HEGC (гіперінсулінемічний еуглікемічний затискач) 29. Вимірювання рівня cgmp печінки 30. Статистичний аналіз 30. 2

5. Результати 31. 5.1. Порівняння ефектів гострого та субхронічного (7 днів) лікування нітрогліцерином та дослідження розвитку інсулінорезистентності у насторожених кроликів 31. Вплив толерантності до гемодинамічних нітратів на основи гемодинаміки та вироблення метгемоглобіну 31. Вплив толерантності до нітратів на використання глюкози 32 Вплив толерантності до нітратів на чутливість до інсуліну 32. Вплив трансдермального нітрогліцерину на чутливість до інсуліну при толерантності до нітратів або його відсутність 33. 5.2. Дослідження впливу толерантності до нітратів та потенційної ролі CCK на явище харчової сенсибілізації інсуліну у кроликів. 34. Гелединамічна толерантність до нітратів до трансдермального NG 34. Зміна індексу RIST у голодних та повторно згодованих нітратно-толерантних та необгодованих тварин 35. Чутливість до інсуліну, виміряна методом HEGC у нітратно-толерантних та непереносимих нітратів натощак та повторно. тварини 36. Сенсибілізуючий ефект інсуліну CCK8 під час рівноважного стану HEGC 36. Вплив інфузії CCK8 на печінковий cgmp у кроликів, що переносять нітрати 37. 6. Обговорення 38. 7. Підсумок 44. 8. Підсумок 45. 9. Література 46. 10. Власні публікації 55. 11. Ключові слова 57. 12. Подяки 58. 13. Додаток 59. 3

1. Скорочення Akt (PKB) протеїнкіназа-b PKC протеїнкіназа-c CCK-1 (CCK-A) холецистокінін рецептор-1 CCK-2 (CCK-B) холецистокінін рецептор-2 CCK-4 холецистокінін тетрапептид CCK-8 холецистокінін октапептид CCK рецептор холецистокініновий рецептор cgmp циклічний гуанозин монофосфат DAG діацилгліцерин GC еуглікемічний затиск ELISA Enzyme Linked Immune Assay enos endothelial nitrate oxide sintase ET-1 endothelin-1 FOXO forkhead boxing protein (protein transmision GGGGTGGGGTGGGGTGGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGGTGGGGTGGTGGGGTGGTGGGTGGTGGGTGGGGTGGGGTGGGTG зв'язуючий білок (зв'язаний з рецептором фактор росту) GSK3 глікоген синтаза кіназа 3 GTN гліцерил тринітрат GTP гуанозин монофосфат HEGC гіперінсулінемічний еуглікемічний затискач HISS Гепітитичний пульс IDDM інсулінозалежний цукровий діабет IP 2 инозитол 1,4-бісфосфат IP 3 інозитол IP 3 5-трифосфат IRS рецептор інсуліну суб шари iv. внутрішньовенно 4

IVGTT IVITT L-NAME MABP MAPK MEK NANC NG NIDDM NO NOS OGTT PDK PHA PI-3-кіназа PIP2 PIP3 PL-C, PLC RAF RAS RIA RIST SD SH2, SH3 SH група SIN-1 SOS SSPG внутрішньовенний тест на толерантність до глюкози внутрішньовенний інсулін NG -нітро-L-аргінін метиловий ефір артеріальний середній тиск активована мітогеном білка кіназа мітоген активована білка кіназа кіназа неадренергічна нехолінергічна нітрогліцерин інсулінонезалежний діабет цукровий оксид азоту оксид азоту синтаза пероральний тест на толерантність до глюкози фосфоїнозитид залежний білок кіназа сплетення печінковий фосфоніт 3-кіназа фосфатидилінозитол 4,5-бісфосфат фосфатидилінозитол 3,4,5-трисфосфат фосфоліпаза-c прото-онкоген серин/треонін протеїнкіназа GTP-зв'язуючий білок SrTP доміцильна група Sr.-морфоліносиднонімін гуанін нуклеотидний замінник білок (Син Севенса глюкоза в плазмі 5

зв’язується з білками. Білки, що зв’язують (також відомі як стикувальні білки), мають спеціальні місця зв’язку, які називаються Вони містять сайти зв'язування SH2, SH3, які дозволяють зв'язувати ферменти (наприклад, PI-3-кіназу, PL-C, GAP тощо). Активація цих ферментів необхідна для передачі ініційованих інсуліном сигналів. Важливо зазначити, що білок IRS є дуже важливим моментом у каскадній системі, оскільки він розгалужений шляхами з різних напрямків (Gustafson et al. 1999; Kellerer et al. 1999). Система транспортування глюкози активується, і глюкоза надходить у клітину. Потім процес протікає або в напрямку накопичення глюкози, або до окислення глюкози, залежно від того, що в даний час потребує організм (DeFronzo 1988, DeFronzo et al. 1979). Малюнок 2. Загальна структура сигнального шляху інсуліну. Гілка сигналізації інсуліну PI3K регулює метаболізм глюкози в скелетних м’язах, жировій тканині та печінці, одночасно стимулюючи вироблення NO та розширення судин в ендотелії судин. Гілка MAPK на шляху передачі інсулінового сигналу загалом регулює мітогенез та контроль секреції ЕТ-1 у ендотелії судин. (див. скорочення у списку скорочень). Джерело: Muniyappa R, Montagnani M, Koh KK, et al. Серцево-судинна дія інсуліну. Endocr Rev 2007; 28: 463-491 9

(наприклад, девазепід) та похідні амінокислот (наприклад, проглумід) (Bock et al. 1986; Chang et al. 1986; Hahne et al. 1981). 20

Виходячи з цих міркувань, основними завданнями експериментальної роботи були: 1. порівняти наслідки гострого та субхронічного (7 днів) лікування нітрогліцерином та дослідити розвиток інсулінорезистентності у кролів, що не сплять, 2. дослідити вплив нітратів толерантність та потенційна роль CCK у харчовій сенсибілізації інсуліну у кроликів. 22

Малюнок 4. Схематичне зображення дослідження. PLAC: плацебо, TDNG: трансдермальний нітрогліцерин, NG: гострий нітрогліцерин (див. Текст для пояснення) Статистичний аналіз Дані аналізували ANOVA з подальшим t-тестом, модифікованим згідно Бонферроні. Отримані результати вважалися значущими, якщо Р