предметів

реферат

Шкіра - це тканина, надзвичайно збагачена ліпідами. Участь ліпідів шкіри у підтримці шкіри та гомеостазі всього тіла добре задокументована 1, 2. Крім того, дисфункція ліпідів шкіри пов’язана з декількома шкірними захворюваннями, такими як вугрі, атопічний дерматит та псоріаз, такими як основні 3, 4, 5, 6. Ліпіди на поверхні шкіри (SSL) походять із суміші ліпідів, отриманих з двох основних джерел ліпідів шкіри. Шкірне сало, аморфний ліпідний матрикс, що виділяється сальною залозою (SG), та епідермальні ліпіди в роговому шарі (SC) представляють основні ліпідні відділи на поверхні шкіри 7 .

Матеріали і методи

Хімічні речовини, реактиви та порівняльні сполуки

Відбір зразків рогового шару людини

Роговий шар (SC) брали з трьох різних ділянок тіла у 10 кавказьких добровольців (8 жінок та 2 чоловіків, середній вік 37,5 ± 7,6 років) шляхом неодноразового зняття пластиру D-SquameTM (CuDerm Corp., Dallas, TX)., США). Добровольці не виявили ознак шкірних захворювань ні в одній із зразків. Зразки СК були взяті з волярної поверхні передпліччя (ARM) та центральної області чола (HEAD) як у жіночих, так і у чоловічих панелей, тоді як SC були взяті з центральної області грудної клітки (ГРУДИ) лише у жінок, завдяки до волосся на тілі, наявного у чоловіків. Дослідження було проведено відповідно до Гельсінської декларації після схвалення Центральним комітетом з етики "Fondazione GB Bietti" за письмовою інформованою згодою кожного добровольця.

підготовка зразка

приладобудування

Хроматографічний апарат складався з високошвидкісної роздільної здатності ВЕРХ 1200 (Agilent Technologies, Німеччина), оснащеної дегазатором, автосборником та термостатом, розміщеним у відділенні для колон від того ж виробника. Для швидкого розділення ВЕРХ із зворотною фазою (RP), Kinetex C8, 50 x 2, 1 мм, 1,7 мкм, зріз частинок, 100 захисна колона з перерізом пор з картриджем SecurityGuard ULTRA перед колоною (Phenomenex, Castel Maggiore, BO, Італія), використовувався максимальний робочий протитиск при 600 бар. Зразки SC та автентичні стандарти елюювали бінарним градієнтом (A): 5 мМ формуату амонію у воді, що містить 20% метанолу/ізопропанолу 95: 5 та (B): метанолу/ізопропанолу 95/5. Рухливі фази фільтрували через скляні фільтри 0,45 мкм і безперервно дегазували у вакуумі. Програма елюції була такою: 0 - 6 хв 60% B, 20 хв 99% B, 20 - 30 хв 99% B, 36 хв 60% B, 36 - 38 хв 60% B. Через 2 хв. при 60% B. Швидкість потоку підтримувалась на рівні 0,4 мл/хв протягом усієї процедури ВЕРХ та протягом часу (2 хвилини). Колонку термостатували при 60 ° C. Об'єм введення становив 4 мкл. Голку для ін'єкцій промивали рухомою фазою в промивному отворі в терміналі ВЕРХ. Витікаючий стік був підключений до двох різних аналізаторів MS для виявлення та характеристики.

Джерело електророзпилювальних іонів і час польоту MS

Точні вимірювання маси та ізотопної структури проводили за допомогою TOF-MS серії G6220A (Agilent Technologies, Німеччина), оснащеному ESI-інтерфейсом, що працює в режимі негативних іонів. Аналіти, елюйовані з системи LC, завантажували на прилад TOF-MS під час попередньої хроматографії (див. Хроматографічні умови). Азот використовували як розпилюючий і розчинний газ. Температура і швидкість потоку сушильного газу становили 350 ° C і 10 л/хв. Напруга капілярів і конусів становила 4000 і 60 В. Спектри мас сканування TOF в режимі сканування отримували в режимі негативних іонів, використовуючи TOF при 10000 масових роздільних здатностях для сканування в межах від 100 до 1200. Сканування MS обробляли за допомогою програмного забезпечення Mass Hunter (версія B.01.03 ). Для поліпшення точного вимірювання маси іонних речовин еталонний розчин випарювали безперервною порцією в розпилювальній камері. Отримані дані були перетворені в масовий центр ваги, з якого було виміряно точне значення m/z. Кількісний аналіз FFA та CHS проводили тим самим методом LC-MS.

ESI-MS з потрійним квадрупольним MS

Спектри ESI маси (MS/MS) отримували за допомогою потрійного квадруполя серії G6410A (QqQ) (Agilent Technologies, Німеччина). Дані отримували в режимі позитивних іонів при одиничній масовій роздільній здатності шляхом сканування іонів між m/z 100 і 1200. Спектри МС усереднювали та обробляли за допомогою програмного забезпечення Mass Hunter. Аналіти, елюйовані з системи LC, вводили в прилад QqQ при робочій швидкості потоку (див. Хроматографічні умови). В якості атомізуючого та сушильного газу використовували азот, а налаштування джерела були такими ж, як і для TOF-MS. Для ідентифікації сполуки були проведені експерименти з преціонованими іонами шляхом сканування третього квадруполя, тоді як експерименти з іонами продуктів (prodION) проводились шляхом сканування першого квадруполя. Другий квадруполь використовувався як комірка зіткнення в обох експериментах. Використана енергія зіткнення становила 34 В, тоді як напруга фрагментатора (F) була встановлена ​​на 140 В.

Обробка даних

Вилучення даних ВЕРХ-МС

Аналіз даних та багатовимірна статистика

Ідентифікація сполуки

Ідентичність сполук, які виявилися значущими в класі поділу, виявленого за допомогою аналізів LC-MS, була підтверджена методом LC-MS/MS, проведеного за допомогою аналізатора маси QqQ за допомогою пристроїв, описаних вище. Експерименти повторювались з хроматографічними умовами, ідентичними описаним для первинного аналізу. Іони були націлені на фрагментацію (CID) фрагментацію, викликану зіткненням в QqQ на основі заздалегідь визначеної точної маси та RT, визначених LC-MS. Порівняння структури пропонованого з'єднання з отриманими фрагментами підтвердило ідентичність. Точні дані про масу та розподіл ізотопів для попередника та іонів продукту вивчали та порівнювали із спектральними даними еталонних сполук, якщо вони є, отриманими за тих самих умов для остаточного підтвердження (HMDB, METLIN).

Кількісний аналіз вільних жирних кислот та сульфату холестерину методом LC-MS

Для кількісної оцінки основних FFA та CHS, послідовне розведення 1: 1 вихідного розчину, що містить пммоль/л справжнього FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 та FA C24: 0 та 10 мкмоль/L CHS. Стандартні розчини аналізували за допомогою LC-MS, описаних вище. Межа виявлення (LOD) та межа кількісної оцінки (LOQ) були розраховані на основі рекомендацій IUPAC 43. Зокрема, LOD визначали як найнижчу концентрацію, яка мала відношення сигнал/шум (S/N) у 3 рази вище, ніж заготовка. LOQ визначали як найнижчу концентрацію, при якій починалася лінійність. Лінійність визначали на основі коефіцієнта кореляції (R). Крім того, точність, внутрішньоденну та міжденну відтворюваність та врожайність визначали шляхом введення розчину 50 та 5 мкмоль/л стандартних FFA та CHS.

Наявність даних

Файли даних, створені під час та/або проаналізовані під час поточного дослідження, можна отримати у відповідного автора за обґрунтованим запитом.

результат

Тестування значущості та аналіз основних компонентів

Після вирівнювання та нормалізації властивості відфільтровували, відбираючи суб’єкти, які були присутні в 100% зразків з будь-якої експериментальної групи, такі як ARM, CHEST та HEAD. У загальній кількості (100%) зразків СК було виявлено більше тисячі (1098) випробовуваних. Відмінності між СК для всіх трьох груп оцінювали за окремими метаболітами за допомогою ANOVA (з p

вплив

(A) Аналіз основних компонентів (PCA) та (B) Діаграми CC, виявлені у 100% зразках принаймні одного стану серед екстрактів ліпідів ARM, CHEST і HE рогового шару (SC). В рамках перших двох основних компонентів (ПК) було пояснено 50,77% загальної дисперсії, з 38,93% у першому вимірі та додатково 11,84% у другому вимірі. Діаграми CC показують значення P-Cor та P-Cov у сутностей, віднесених до складу керамідів (рожеві точки), вільних жирних кислот (зелені точки) та сполук споріднених із сульфатом холестерину (червоних крапок) серед об'єктів, виявлених у 100% зразках у принаймні одна умова (чорні крапки).

Повнорозмірне зображення

Зміни складання та кластеризація

Повнорозмірне зображення

Ієрархічне групування 52 суб’єктів, які були регулярно модифіковані при порівнянні ARM до CHEST, CHEST до HEAD і ARM до HEAD, як показано на фіг. 2. Ідентичність коментованого FFA та сульфату холестерину підтверджено порівнянням зі спектрами RT та MS/MS відповідної справжньої сполуки. Анотації керамідів були підтверджені після генерування спектрів MS/MS.

Повнорозмірне зображення

Профілі розподілу вільних жирних кислот у СК з передпліччя, грудної клітки та чола

Кількісний аналіз основних вільних жирних кислот у СК та сульфату холестерину за допомогою LC-MS

Для визначення рівнів СНС та кількості основних характеристик FFA шкірних жирів та ліпідних бар'єрів епідермального ліпіду, таких як FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 та FA C24: 0, застосовується кількісний метод, заснований на поділі RP -HPLC і встановлено виявлення РС у режимі негативних іонів. Лінійність, LOD, LOQ та регенеративна форма матриці оцінювали для справжніх цільових стандартів аналіту. Метод був оптимізований для кількісного визначення FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 та FA C24: 0 та CHS у SC від ARM, CHEST та HEAD. FFA та CHS були кількісно визначені щодо дейтерованих внутрішніх стандартів d14-PoA та d7-CHS. Визначені умови продемонстрували задовільну лінійність, відтворюваність, вихід, чутливість та LOQ, як показано в таблиці S4. Щоб нормалізувати результати до ваги зразка СК, кількісні кількості поділяли на мг проби. Цільові концентрації FFA, визначені кількісно в SC, відповідали відносним відсоткам, що спостерігались для ARM, CHEST та HEAD при нецільовому підході. Оскільки кількісні результати, показані на фіг. 4 як нмоль/мг SC, себум-специфічна FFA, така як FA C16: 1, зросла в порядку ARM

Результати кількісних оцінок біомаркерів секреції шкірного сала та ліпідів бар'єру проникності епідерми в ліпідних екстрактах ARM, CHEST та HEAD SC. FFA та CHS визначали кількісно за допомогою LC-MS, тоді як рівні холестерину та сквалену оцінювали за допомогою GC-MS. Графіки віконця показують концентрацію, виражену як нмоль/мг SC в ARM (зелений ящик), ГРУДИ (помаранчевий ящик) та HEAD (сірий ящик). Короткий виклад таблиці на малюнку показує середню концентрацію, позначену червоним хрестиком у відповідному графіку поля, та значимість, оцінену ANOVA.

Повнорозмірне зображення

Кількісний аналіз холестерину та сквалену в СК за допомогою ГХ-МС

Для підтвердження відмінностей, що спостерігаються у відносній кількості епідермальних ліпідів та сальних ліпідів відповідно до розподілу SG, відповідні біомаркери, а саме холестерин та сквален, були кількісно визначені за допомогою GC-MS на аликвотах тих самих екстрактів SC, які раніше аналізували LC-MS. Кількісні результати повідомляються як nmol холестерину та сквалену для мг SC на Фіг. 4 разом з LC-MS кількісним аналізом FFA та CHS. ANOVA продемонструвала, що рівень холестерину значно знижувався з районів, бідних на СГ, на багаті на СГ. На відміну від цього, значне збільшення концентрації сквалену спостерігалось, коли HEAD порівнювали з місцями ARM та CHEST.

обговорення

Широкомасштабна шкірна ліпідомія продемонструвала широкі внутрішньо-індивідуальні варіації SSL за регіональною площею тіла у людей36. Лобова, лобова, молочна та плечова області демонстрували виражений ліпідний профіль у порівнянні з будь-яким іншим місцем тіла через сальний відбиток пальців, який здебільшого був пов’язаний з більш високим рівнем тригліцеридів та дигліцеридів 36. Наші аналітичні умови були обрані для оптимального виявлення епідермальних бар'єрних ліпідів, таких як кераміди та CHS, разом з FFA. Велика кількість конкретних членів сімейства FFA є відмінною рисою матриці SPB та шкірного сала. У нашому середовищі FFA був найвидатнішим ознакою сальних ліпідів. Отримані нами результати узгоджувались із спостереженням за різними структурними організаціями ліпідних ламелей, отриманих із корнеоцитів стопи та чола, де вміст шкірного сала виявлявся на низькому (1 мкг/см 2) та високому (200 мкг/см 2) рівнях, 60 . Раманівська спектроскопія показала, що вміст ліпідів був збільшений в дермі шкіри, багатої SG-вою, порівняно з шкірою, бідною на SG, демонструючи поглинання компонентів шкірного сала епідермісом і нижніми тканинами. .

Дякую

Дослідження було проведено в рамках основної програми досліджень, що фінансується Міністерством охорони здоров'я Італії.